Membrántechnológia és vakcinatisztítás (Ⅱ)

Az előző cikkben volt néhány előzetes bevezetőnk az oltásokba és az oltóanyag tisztázási stratégiáiba, és a cikk további részében folytatjuk ezek feltárását. A fentieket követően továbbra is megosztjuk a vakcina tisztázásait és a kapcsolódó membránszöveti alkalmazásokat.

 

2.2.2 A vírus fizikai és kémiai tulajdonságainak hatása

A termelési rendszer és a megfelelő szennyeződések tisztítási lépésben történő eltávolítására szolgáló módszerek mérlegelése után fontos figyelembe venni a vírus jellemzőit, és a vírushozam maximalizálására kell összpontosítani.

 

2.2.2.1 Könnyű vírusadszorpció
Pozitív töltésű anyagokat és szűrési segédanyagokat (például kovaföldet) fejlesztettek ki a mélyszűrési hatások javítására. Bár a pozitív töltés növeli a nukleinsavak és a HCP befogását, a kovaföldről ismert, hogy megköti a sejttörmeléket és a kolloidokat. Ezek az anyagok azonban az adszorpciós mechanizmuson keresztül is megtarthatják a vírust. Mivel a vírus oldatban általában negatív töltésű, elektrosztatikus kölcsönhatások léphetnek fel a pozitív töltésű szűrővel.
A vírusok hidrofób vagy nem specifikus kölcsönhatásaik révén is kötődhetnek bizonyos szűrőanyagokkal (például kovafölddel vagy üvegszálakkal). A burkolt vírusok lipidburokuk miatt érzékenyebbek erre az adszorpcióra. Ha a vírus elektrosztatikus kölcsönhatások révén adszorbeálódik a szűrőn, és a vírusrészecskék a sókompetíció miatt leválnak, a szűrő nagy vezetőképességű pufferrel történő öblítése részben visszanyerheti a vírust. Ez azonban a szennyeződéseket, például a HCP-t vagy a nukleinsavakat is eluálhatja. Ezért egy alternatív szűrőanyag, például az inertebb polipropilén alkalmazása előnyös.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
Köztudott, hogy az influenzavírusok hajlamosak az adszorpció elvesztésére a derítés során. Ezért az influenza gyűjtés tisztázására alkalmas a töltésmentes szűrő, a polipropilén alapú szűrő alkalmazása. Thompson és munkatársai egy névleges névleges méretű, 1,2 μm-es polipropilén szűrő, majd 0,45 μm PVDF membrán használatáról számoltak be az MDCK sejtek által termelt sejtalapú influenzavírus tisztázására. Összesen kilenc tisztítási tesztet végeztek 20L-es skálán, 111 l/m2 terhelést 1,2 μm-es polipropilén szűrőnél és 105 l/m2-t 0,45 μm-es PVDF szűrőnél. Az eredmények azt mutatták, hogy a futó vírusok többsége jól gyógyult (78-154%). Arról is beszámoltak, hogy a hcDNS 58%-át eltávolították, de nem szignifikáns HCP-eltávolítást.

 

2.2.2.2 Érzékeny vírusok levágása

Egyes vírusok (kapszulázott vagy nem kapszulázott) alacsony mechanikai ellenállást mutatnak, és a centrifugálási és membránszűrési lépések során nyírás hatására elpusztulhatnak. A szűrést vagy kromatográfiát magában foglaló tisztítási lépések során keletkező nyíróerők a vírusburok leesését okozhatják, így befolyásolva a fertőzőképességet. A kapszid méretétől, vastagságától és geometriájától függően a víruskapszid lehet törékeny, vagy fordítva, ellenáll a nagy nyomásoknak. Egyes burokkal rendelkező vírusok, például az influenzavírusok, rugalmasak a mechanikai igénybevétellel szemben, és ellenállnak a nagy deformációknak. Másrészt a nyíróerő a kevésbé rezisztens vírusok, például a retrovírusok burkának leesését okozhatja, ami befolyásolja a vírus fertőzőképességét.

Az extracellulárisan generált burkológörbe VLP-k szintén nagyon sérülékenyek. A centrifugális folyamat során nagy nyírási sebesség keletkezik, főként a bemeneti és kimeneti részeken (nagy nyírási sebesség keletkezik a gáz-folyadék határfelületen). Amikor a vírust gradiens centrifugálással tisztították, egyes retrovírusok transzdukciós képessége jelentősen gyengült. A centrifugális elválasztás tervezésekor figyelembe kell venni a vírusrészecskék nyíróerőkkel szembeni viszonylagos instabilitását. A centrifugális erő nem az egyetlen nyírási ütés forrása, sokkal fontosabb a berendezés kialakítása, különösen az import és az export esetében is jelentős nyírási sokk. A különböző skálák kialakításának különbségei a nyírásra érzékeny vírusok hozamában és visszanyerésében eltérésekhez vezethetnek a különböző léptékekben.

A nyírásra érzékeny vírusokat gondosan kell megtervezni, mert a nyírófeszültség nagysága és a feszültségnek való kitettség ideje (a recirkuláció miatt) magas lehet. A nyírásra érzékeny vírusok esetében előnyben részesítik a nyitott áramkörű eszközöket (üreges szálas vagy nyitott lemezes eszközök), hogy csökkentsék a turbulenciát és a nyíróerőket az adagolócsatornában.

A működési paraméterek megválasztásának minimálisra kell csökkentenie a vírusrészecskék károsodását: alacsony keresztáramlás, közepes transzmembránnyomás (TMP) és rövid feldolgozási idő.

A membrán nagy nyomás alatti szennyeződése a vírus fertőzőképességének elvesztéséhez vezet, feltehetően azon erők miatt, amelyek a nyíróhatást a vírusburokra hatnak. A membrán alapú elválasztás a méreten alapul, és a nagy molekulatömegű vírusgátlók és vírusrészecskék felhalmozódása csökkentheti a vírusvektorok fertőzőképességét.

A nyírásra érzékeny vírusok mélyszűrés során bekövetkező lebomlása nincs széles körben dokumentálva. A mélyszűrés során a vírusok elvesztése leggyakrabban a befogásnak, adszorpciónak vagy a termék idő- és hőmérsékletfüggő vírusdegradációjának tulajdonítható. Valójában annak ellenére, hogy mechanikai igénybevétel előfordulhat az NFF-rendszerekben, az NFF-termékek nyírási expozíciós ideje nagyon rövid más technológiákhoz képest, mivel az NFF-termékeknél tapasztalható gyors egyszeri áthaladás.

 

2.2.2.3 Elfogás a rekesznyílás méretének megfelelően

Az 100 nm-nél nagyobb vírusok megtarthatók a mikoplazma vagy a steril minőségű membránok (0,22 μm és az alatti) eltávolításával. Ebben az esetben különös figyelmet kell fordítani a szűrők kiválasztására. A mikroszűrés TFF lépéseihez a 0,45 μm-es vagy 0,65 μm-es membránokat részesítik előnyben a jó termékcsatornákhoz. NFF többlépcsős szűrés esetén a legsűrűbb réteg 0,45 μm vagy annál nagyobb. A mélyszűrő kiválasztásakor körültekintően kell eljárni, mivel egyes mélyszűrős készülékek filmréteget tartalmazhatnak, ami termékvesztést okozhat a retenciós meghajtó miatt. A vírus aggregációja negatívan befolyásolja a vírustermelést, és a vírus mérete miatt fokozza a vírus visszatartását.

Andre és Champluvier szabadalma szerint a homogenizálás megakadályozhatja vagy korlátozhatja a szűrő eltömődését az aggregátum méretének csökkentésével, ami nagyobb hozamot biztosít. A homogenizálás javította a betakarítás szűrőképességét is, amely 2.4-3-szeresére nőtt.

A túl sok szennyeződés akadályozhatja a vírus helyreállítását. A szennyeződések hajlamosak eltömíteni a szűrőt, és az eltömődött membránpórusok csökkenthetik a vírus átjutási sebességét. De Vocht és Veenstra szabadalma megemlíti, hogy a nagy sejtsűrűség közvetlen tisztázása Per. A TFF-fel ({{0}}.65 vagy 0.2 μm membrán) történő gyűjtés adenovírusmentes vírus-visszanyerést eredményezett. A helyreállítás a gazdasejt DNS szelektív precipitációs eltávolításával érhető el a 0,65 μm-es TFF lépés előtt. Az adenovírusok 70%-a.

 

 

2.3 Esettanulmány: A vírusvakcinák tisztázásának optimalizálása

A 2011-es Nemzetközi Biológiai Folyamatkonferencián Sanofi Pasteur egy racionális megközelítést mutatott be a szűrőszűrők szűrésére a vírusvakcinák új, tisztázott szekvenciáinak kifejlesztéséhez. A kutatás célja a sejt- és vírustenyésztési folyamatok optimalizálása során felmerülő problémák leküzdése. Az upstream folyamat módosítása 20%-os hozamveszteséget és idő előtti szűrőszennyeződést eredményezett a derítési lépés során, ami nem eredményezett méretnövelést. A robusztus és skálázható tisztázási lépés létrehozásához a szűrőszekvencia teljes újrafejlesztésére volt szükség, 85%-nál magasabb vírusvisszanyerési arány mellett.

Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80%. A cellulóz-észter és üvegszálas szűrők visszanyerési aránya a szűrő értékelésétől függ (20% vagy 90%).

Második lépésként a Sanofi Pasteur a szűrési vizsgálatban előre kiválasztott hét szűrő több kombinációját (2. vagy 3. fázis szekvenciák) értékelte. Az állandó áramlási osztályozási tesztet kis szűrővel végeztük. Ezenkívül ez a kísérlet magasabb hozamot használt, mint a szűrővizsgálat. A vírusvisszanyerés és a szűrőkapacitás eredményei alapján a csapat a két legjobb kombinációt választotta további tanulmányozásra.

- 1. szekvencia (2. szakasz): 30 μm névleges névleges hajtogatott polipropilén előszűrő, majd egy kompozit cellulóz-észter és üvegszál többrétegű szűrő (1/0,5 μm porozitás)

- 2. szekvencia (3. szakasz): ugyanaz az előszűrő (30 μm névleges névleges polipropilén szűrő), majd egy közbenső többrétegű polipropilén szűrő és végül egy aszimmetrikus poliéter-szulfon film.

 

The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85%), amint azt az 1. ábra mutatja.

1. ábra Átlagos vírus-helyreállítás minden szűrési lépésnél. A stabilitási vizsgálatokat három szűrési szekvenciára értékelték ki, amelyek közül csak az 1. szekvencia 30 μm-es névleges névleges hajtogatott polipropilén és 1.{5}}/0,5 μm cellulóz-észter és üvegszálas szűrő alkalmazásával érte el a globális visszanyerési célt. .

Elsődleges derítési lépésként a centrifugálást is értékelték, amelyet {{0}},45 μm végső szűrés követett. Számos sebesség/időtartam párost teszteltek. Bár a 0,45 μm-es szűrési sebesség kétszeresére nőtt, a végső hozam alacsonyabb volt, mint a kitűzött 85%. Ennek eredményeként a centrifugálást nem vizsgálták tovább.

Végül a polipropilén és üvegszálas szűrési szekvenciák teljesítményét nagyobb léptékben (160 literes bioreaktor mérete) értékeltük. A szűrési sorrend a 2. ábrán látható.

A 2. ábra tisztázza a szűrőkombinációt és grafikusan ábrázolja a karakterlánc lépéshozamát. Az A vonat a hagyományos folyamat, a B vonat pedig az optimalizált folyamat. Az optimalizált B szekvencia 3-szorosára csökkentheti az előszűrési területet, törölheti a közbenső szűrési lépést, és 10-szer csökkentheti a végső szűrési területet, így 3%-kal nő a globális vírusvisszanyerés.

Több tételt sikeresen tisztítottak, a szűrő eltömődésének jelei nélkül, a gyártási idő a gyártási határértékeknek megfelelő volt, és a vírushozam több mint 85 százalék volt. A tisztázási lépések optimalizálása nem volt hatással a vakcina későbbi lépéseire és kulcsfontosságú minőségi tulajdonságaira. Ezért a kiválasztott derítési szekvenciát alkalmaztuk a vakcinagyártási folyamatban (1000 l méretű bioreaktor), és a teljesítményt sikeresen igazoltuk.

 

03 Bakteriális vakcinák tisztázása

3.1 Megfontolások a bakteriális vakcinák tisztázásához

A Medical Thesaurus (2015) szerint a bakteriális vakcina hígított vagy elpusztított baktériumok vagy antigén származékaik szuszpenziója, amelyet immunválasz kiváltására használnak bakteriális betegségek megelőzésére vagy kezelésére. Általánosabban, a bakteriális vakcinák az aktív antigén típusa alapján négy alkategóriára oszthatók. Ez az ügynök lehet:

- Megöli vagy legyengíti az egész élő baktériumot. Más néven BCG vakcina.

- Antigéndeterminánsok tisztítása (alegység vakcinák). Anthrax vakcina vagy acelluláris pertussis vakcina.

- Bakteriális toxinok (toxoidok). Diftéria és tetanusz toxoidok.

- Plazmid (pDNS).

A család termékeinek széleskörű heterogenitása miatt az upstream és a downstream folyamat kihívásai nagymértékben függenek az előállított vakcina típusától. Ezért a kezdeti fermentációs lépés után tisztítható vagy nem tisztítható, így a derítési lépés végrehajtható.

 

3.2 A bakteriális vakcina tisztázási stratégiája

3.2.1 Toxoid

A vakcina felhasználására előállított két leggyakoribb toxoid a diftéria és a tetanusz, amelyeket a Corynebacterium diphtheriae, illetve a Clostridium tetani termel. Mindkét vakcina előállítására szigorú szabályozási követelmények vonatkoznak. A WHO technikai jelentése és mellékletei egyértelmű ajánlásokat fogalmaznak meg a tetanusz és diftéria elleni oltások minőségének, biztonságosságának és hatékonyságának biztosítására. Az általános jó gyártási gyakorlat mindkét vakcina előállítására vonatkozik, és az alkalmazottaknak megfelelő képzésben kell részesülniük, és mindkét betegség ellen emlékeztető oltást kell kapniuk.

A GMP szigorúan megköveteli, hogy igazolni kell a végtermék tisztaságát és minőségét. A WHO és az EP szerint a végleges tetanusz vakcina hatékonyságát a tetanusz toxoidra vonatkozó nemzetközi szabvány szerint nemzetközi mértékegységben kalibrált megfelelő referenciaanyaggal való összehasonlítással vagy bármely más bizonyított módszerrel kell meghatározni. A hatékonyságra vonatkozó frissített követelményeket 2011-ben tették közzé, és az értékelési módszertől függően változhatnak. Minden vakcinatétel biztonságosságát (toxinmentes és helyreállító toxicitást) szintén igazolni kell. Végül foglalkozni kell a vakcinák stabilitásával, különösen valós időben.

 

3.2.2 Plazmid DNS vakcina

A plazmid DNS-vakcinákat állat-egészségügyi célokra használják, és számos emberi felhasználásra szánt plazmid DNS-vakcina a fejlesztés és a klinikai értékelés különböző szakaszaiban van. Az E. coli fermentáció után a baktériumokat összegyűjtjük és hasítjuk, hogy felszabadítsuk a plazmid DNS-t.

A sejttörmelék eltávolítása általában centrifugálással vagy szűréssel történik. A témával a közelmúltban megjelent kiadványok széles körben foglalkoztak. Ebben a kiadványban a pDNS aktuális upstream, downstream és formulázási folyamatait és kihívásait ismertetjük.

A szerzők betekintést nyújtanak a tipikus pDNS gyártási folyamat egyes lépéseinél tapasztalható hiányosságokba és a lehetséges jövőbeli innovációkba és/vagy a jelenlegi technológiai hiányosságokba is, amelyek a folyamat további optimalizálásához vezethetnek.

A plazmid DNS-vakcinákat két lépésben állítják elő. Először a baktériumsejteket eltávolítják a táptalajból, másodszor pedig a sejttörmeléket a sejtlízis után. A mérettől függően a sejteket centrifugálással vagy TFF mikroszűréssel gyűjtjük össze. A tárcsás centrifuga szakaszosan nagy sebességgel kilökődik, és a szupertekercses plazmidok hozama gyenge a kisütés közbeni nyírási károsodás miatt. Ha centrifugálást kell alkalmazni, a legjobb a szilárd tálcentrifuga. A nyitott csatornás, lapos TFF-eszközök 0,1 vagy 0,2 μm-es mikroszűrő membránokkal vagy üreges szálas eszközökkel jól működhetnek.

Mivel az üreges szálas eszközök nagy szilárd teherbírással rendelkeznek, néha elsőbbséget élveznek. Ezek a folyamatok jellemzően a koncentráció 3-5-szeresével működnek, amit 3-5 térfogatnyi transzfiltráció követ. A nyírás csökkentése és a membránpolarizáció jobb szabályozása érdekében erősen ajánlott a penetráció szabályozása. Bár a centrifugák költséghatékonyabbak a nagyméretű kereskedelmi műveleteknél, a kisebb méretű eljárások általában szűrést alkalmaznak a hordozhatóság és a könnyű kezelhetőség miatt.

Flokkulálószereket használtak a feldolgozás megkönnyítésére, de ez termékvesztéshez vezethet. Néhányan inert kovaföld részecskék használatát is javasolják, majd zsákos szűrést.

Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>A 0,45 m) membránszűrők jól eltávolítják a sejttörmeléket. A sejttörmelék erős eltömődése miatt az alacsony áramlású vagy alacsony nyomású szűrést részesítik előnyben. Ehhez a lépéshez Tff-alapú mikroszűrőket és ipari méretű zsákszűrőket használtak. A statikus (keverőedényben) és a folyamatos (soros statikus keverővel) repesztéshez különböző szűrőkre van szükség.

 

3.3 Esettanulmány: A centrifugálás, az NFF és TFF módszerek hatékonyságának összehasonlítása a tetanusz toxinok tisztítására

Muniandi et al. Három különböző módszert hasonlított össze a tetanusztoxinok és toxoidok fermentációs folyadékokból történő tisztítására, nevezetesen a centrifugálást, a mélyszűrést (NFF) és a TFF-et. A tesztanyagot 400 literes fermentorban állítottuk elő módosított Miller (MMM) táptalaj felhasználásával. A centrifugálási vizsgálat során a sejteket 4000 fordulat/perc sebességgel választottuk el a szívtől egy 6 × 1 literes tartályban 60 percig. A felülúszóból mintákat vettünk a toxoid visszanyerésének kimutatására. A mélyszűrés 0,45 μm és 0,22 μm mélységű kovaföldet és cellulózt tartalmazó szűrőket használ a fermentlé derítéséhez. Az eljárást 35 fokos hőmérsékleten és 12 psi nyomáson hajtják végre.

Egy nyitott lapos paneles TFF modult termikusan kötnek egy 0,22 μm méretű PVDF membránhoz a TFF módszerrel. A TFF-alapú derítési eljárást 2000 l/h keresztáramlási sebességgel hajtottuk végre 23 fokon, és a tisztított szűrletet 1000 l/h keresztáramlási sebességgel töményítettük 25 fokon hagyományos TFF szendvics 30 kD PES membrán segítségével. A tisztított húsfolyadék (körülbelül 6 liter) 10-szer koncentrálódik ebben az ultraszűrési eljárásban. Tetanusz toxoid teszteket végeztünk koncentrált mintákon a termék visszanyerésének értékelésére.

A mélyszűrés körülbelül 89%-os termékvisszanyerési arányt eredményezett, míg a TFF egységek 97% feletti termékvisszanyerési arányt eredményeztek. A mikroszűrési és ultraszűrési eljárások következetesen magasabb termékvisszanyerést eredményeznek, mint az NFF eljárás. Ezek az eredmények flokkulációs teszteken (Lf) alapulnak.

 

04A poliszacharid vakcinák tisztázása

4.1 A poliszacharid vakcina tisztázásának mérlegelése

Mind a nem kapcsolt/szabad poliszacharid vakcinák, mind a kapcsolt poliszacharid vakcinák előállítási folyamata a gazdabaktériumok fermentorban történő tenyésztésével kezdődik. A fermentáció végén a baktériumokat tisztítószerekkel, például DOC-val (nátrium-dezoxikolát), Triton®X{0}} vagy más megfelelő reagensekkel lehet kezelni, hogy elpusztítsák a baktériumokat és elősegítsék a poliszacharidok felszabadulását. A nagy akkumulátorkapacitás miatt a közvetlenül NFF-en keresztül történő begyűjtés gazdaságilag nem kivitelezhető, mivel az áteresztőképesség nagyon alacsony lehet. Ezért az ideális választás egy centrifuga használata a sejtcsomók elkülönítésére. A TFF mikroszűrési sorozat is használható. A kérdéses poliszacharidot tartalmazó sejtmentes centrumot/penetránst tovább tisztítjuk NFF mélyszűrő rendszerrel, majd biobattered szűréssel, majd folytatjuk a kezelést a további tisztítás céljából.

 

4.2 Poliszacharid vakcina tisztázási stratégia

4.2.1 Első tisztázási eljárás

A centrifugálás az egyik legelterjedtebb technika a sejtek és a fermentációs folyadékok elválasztására. Léptéktől függően választható a folyamatos centrifugálás vagy a szakaszos centrifugálás. Fontos megjegyezni, hogy a centrifugálási körülmények és működésük megfelelő optimalizálása elengedhetetlen a sikeres downstream tisztításhoz. Egy adott TFF membrán és pórusméret kiválasztásakor fontos szem előtt tartani a poliszacharidok molekulatömegét, amelyek gyakran nagyok és szerkezetileg összetettek, molekulatömegük körülbelül 500 kDa. több mint 1000 kDa. A nagy nyitott pórusméret miatt a 0,22μm, 0,45μm, 0,65μm MF membránok alkalmazása biztosíthatja a PS molekulák sikeres visszanyerését az ozmotikus oldatban.

 

4.2.2 Másodlagos tisztázási eljárás

A másodlagos derítési lépést elérő sejtmentes fermentációs oldat tisztasága/turbiditása az adott baktériumtól, a hasítás típusától, az egyedi szérum típusától és az elsődleges derítési lépéshez használt technikától függ. A központ zavarossága körülbelül 50 és 150 NTU között lehet. A töltött cellulózszálakkal impregnált kovaföldből készült pozitív töltésű, frakcionált sűrűségű mélyszűrővel deríthető és zavarossága <5NTU-ra csökkenthető.

Ennek a mélyszűrőnek a térfogata körülbelül 150 l/m3 és 250 l/m3 között lehet. Általában a tisztított termékoldatot egy következő 0,45 μm-es biológiailag támogatott redukciós fokozaton vagy 0,22 μm-es sterilizált minőségű membránon szűrik át, hogy eltávolítsák a megmaradt sejtrészecskéket, kolloidokat és potenciális mikroorganizmusokat.

 

4.3 Esettanulmány: A Streptococcus pneumoniae fermentlé központjának tisztázása centrifugálás után

A sejteket {{0}},1% (v/v) 8-as típusú Streptococcus pneumoniae fermentlé (20 l) hozzáadásával választottuk el, folyamatos centrifugálással. A kollekció közepét két különálló pozitív töltésű és kovaföld mélyszűrőn keresztül szűrjük, amelyek cellulózszálakat tartalmaznak. Az egyedi mélyszűrő szűrletet ezután biológiailag terhelt redukciós minőségű PVDF 0,45 μm membránon szűrtük. Minden szűrési tesztet állandó áramlású üzemmódban, perisztaltikus szivattyúkkal végeztünk. A feltöltött mélyszűrővel és Streptococcus pneumoniae 8-as szerotípusú fermentlevessel végzett szűrési tesztek eredményeként a zavarosság körülbelül 120 NTU-ról 3 NTU-ra csökkent. A teszteket 140 150 l/m2/óra áramlási sebességgel és 20-25 psi végponti nyomáskülönbséggel végezték, körülbelül 180-200 l/m2 térfogatáram mellett.

Hasonló szűrési vizsgálatokat végeztünk a Streptococcus pneumoniae 19A szerotípusú fermentlével. A centrifugált 19A-es folyadékot feltöltött mélyszűrőn keresztül tisztítják, ami a zavarosságot körülbelül 40 NTU-ról 3 NTU-ra csökkenti. A teszteket állandó, körülbelül 140-160 L/m2/óra áramlási sebességgel végeztük, és a térfogati áteresztőképesség 200-230L/m2 volt körülbelül 15 psid végponti nyomás mellett. A szűrési kiértékelő tesztek során gyűjtött termékminták HLPC analízise nem mutatott ki jelentős hozamcsökkenést a mélyszűrésnél vagy a 0,45 μm-es (vagy 0,22 μm-es) membránoknál.

 

05 Következtetés

A derítési eljárások fejlesztése több egységfolyamat integrálását igényli, mint például a centrifugálás, a TFF-MF, a mélyszűrés és az aszeptikus szűrés. A tisztázási folyamat optimalizálásához meg kell érteni, hogy a különböző egységműveletek hogyan hatnak egymásra. A kihívás az, hogy olyan technológiákat és eszközöket (berendezéseket és berendezési tárgyakat) kell kiválasztani, amelyek megfelelnek a mai, hatékonyabb bioreaktorok által előállított technológiai folyadékokkal szemben támasztott egyre összetettebb követelményeknek. Az upstream termelékenység (vírustiter, sejtsűrűség stb.), a sejttörmelék és a sejtlízis termékek növekedése megnehezíti a derítési folyamatot, és megzavarja az elválasztási és szűrési berendezés kiválasztását.

A folyamatlépték kiválasztásakor figyelembe kell venni a berendezés kialakítását, a könnyű használhatóságot és a tisztaságot. Ez biztosítja a hatékony átalakítást és a kezelő biztonságát az eldobott szűrők kezelésekor. A derítési folyamat fejlesztése érdekében fontos a derítési lépések erős integrációja annak biztosítása érdekében, hogy az upstream betakarítás feldolgozása költséghatékony legyen. Számos szűrőegység áll rendelkezésre a laboratóriumi tesztelés, a kísérleti gyártás és a teljes méretű feldolgozás megkönnyítésére. Egy jól megtervezett, több derítési opciót kiértékelő nagyítási munkaterv megvalósításával magabiztosan választhatunk ki és méretezhetnek a derítőszűrőket, hogy megvédjék az egység műveleteit, miközben csökkentik a működési költségeket.

A vakcina tisztázása számos kihívást jelent. A szűrési folyamatot jellemzően a termelési rendszerhez, az inaktiváló vagy lizáló szerhez és az antigén bemutatásához kell igazítani, nem feltétlenül a vakcinákhoz. A hagyományos vakcinázási eljárások általában centrifugálással kezdik a vakcinát. A többféle technológiai platformmal és kisebb feldolgozási mennyiséggel rendelkező modern vakcinák alkalmasabbá teszik a vakcinákat a membránalapú technológiákkal történő tisztításra. Az újonnan kifejlesztett vakcinák modern sejtvonalakat és expressziós rendszereket használnak, és pontosabban meghatározott sejttenyésztési körülményeket használnak, és számos vakcina eljárást jobban elősegítenek a szűréshez.

 

A vakcinatermékek antigénkomponensének vagy „célantigénjének” heterogenitása azonban megnöveli a szűréssel történő derítés bonyolultságát. Az antigének mérete, felületi kémiája és töltése változó. Ezek a jellemzők befolyásolják az antigének hozamát és kinyerését. A vakcinák egyedülálló kihívást jelentenek a tisztázás terén, főként makromolekuláik mérete miatt. Ez a tisztázás körüli képességproblémákkal együtt megnöveli a folyamatfejlesztési stratégiákkal kapcsolatos útmutatás szükségességét.

A vakcinagyártás kereskedelmi méretű műveleteinek mérete és léptéke jelentős hatással van a derítési technológia megválasztására. Mivel a folyamat előtt található, a megfelelő derítés-optimalizálás kritikus fontosságú a downstream egység műveleteinek sikeréhez, maximalizálva a hozamot, a visszanyerést és a folyamat robusztusságát. Míg a centrifugálás továbbra is életképes műszaki lehetőség az elsődleges derítéshez, a vakcinaiparban egyre elfogadottabbak a nyílt csatornás mikroszűrő egységek (TFF) az elsődleges tisztításhoz, valamint a finom mélyszűrők vagy a membránszűrők a másodlagos derítéshez. Ezt a változást a gyorsabb feldolgozás, a gyors folyamatfejlesztés, a hordozható folyamatok és az egyszer használatos megvalósítások iránti igény okozza. Az NFF gazdaságos eljárást kínál, amely alkalmas kis és nagy méretű egyszer használatos opciókhoz. A változó szabályozási igények miatt az autoklávozásra tervezett gamma-besugárzást megelőző aszeptikus eszközök vagy modulok elérhetősége elősegíti az NFF vagy TFF alapú technológiák gyorsabb adaptációját.

Sok klasszikus oltási eljárás magában foglalja a tisztítóegység-műveletek fejlődését, nagyrészt a szabályozási korlátok, valamint az újbóli érvényesítés és az újbóli benyújtás vagy a klinikai vizsgálatok magas költségei miatt. A szűrés alapú derítési sémát alkalmazó platformeljárást számos biológiai ágensben széles körben alkalmazták, nagy sikerrel. Az ebben a dokumentumban felvázolt példák és esetek azt mutatják, hogy az oltóanyaggyártók a sablonos megközelítés követésével képesek elérni a stabilitás, a gazdasági életképesség és az egyszer használatos hasznosság ilyen szintjét.

A szűrés további előnyei a centrifugálással szemben a nyírásra érzékeny vírusok vagy a levegő határfelületén felhalmozódó vírusok. Ahogy az eszközgyártók új termékeket hoznak piacra, a vakcinagyártók továbbra is jobban felkészültek a tisztázási folyamatra.

 

A lokalizációs kör első vállalataként a Guidling Technology elegendő releváns tapasztalatot halmozott fel a vakcinák tisztázása terén. A Guidling Technology egy fejlesztő és gyártó cég, amely a biogyógyszerészeti és sejttenyésztésre, a tisztításra és az elválasztásra összpontosít. A termékeket széles körben használják a biomedicinában, diagnosztikában, ipari folyadékszűrésben, kimutatásban, tisztázásban, tisztítási és koncentrálási folyamatban; A Guidling sikeresen fejlesztette ki az ultraszűrő centrifugacsövet, ultraszűrő/mikroszűrő membránkazettát, víruseltávolító szűrőt, tangenciális áramlású szűrőeszközt, mélymembránköteget stb., amelyek teljes mértékben megfelelnek a biofarmakon és a sejttenyésztés alkalmazási forgatókönyveinek.

Membránjainkat és membránszűrőinket széles körben használják az előszűrés, a mikroszűrés, az ultraszűrés és a nanoszűrés koncentrálására, extrakciójára és szétválasztására. Széles termékcsaládunk, a kis egyszer használatos laboratóriumi szűréstől a gyártási típusú szűrőrendszerekig, a sterilitásvizsgálaton, a fermentáción, a sejttenyésztésig és egyebekig kielégíti a tesztelés és a gyártás igényeit.