Az MRNA gyógyszergyártási folyamat teljes elemzése: Hogyan oldja meg a TFF technológia a tisztítási kihívásokat
Az elmúlt években az mRNS-technológia áttörést ért el a biofarmakon területén, és óriási alkalmazási potenciált mutatott be, különösen a vakcinák és a génterápia területén. Az mRNS-vakcinák sikeres fejlesztése nemcsak a fertőző betegségek megelőzésében és leküzdésében jelentett új megoldásokat, hanem a rák immunterápia és a személyre szabott orvoslás fejlődését is elősegítette. A terápiás termékek új osztályaként a nagyszabású mRNS előállítása nagy kihívást jelent, beleértve az RNS stabilitásának ellenőrzését, a maradék enzimek eltávolítását és a melléktermékek reakcióját, a puffercserét, valamint a magas tisztaságú-visszanyerési arány elérését, amelyek mindegyike gyártási technológiát igényel a szabályozási-megoldásokkal.
Az mRNS vakcinák vagy terápiás szerek gyártási folyamata alapvetően három szakaszra oszlik: plazmid DNS ömlesztett oldat elkészítése, mRNS bulk oldat elkészítése és mRNS–LNP gyógyszerkészítmény előállítása.
mRNS gyógyszergyártási folyamat folyamatábrája
A tangenciális áramlási szűrést (TFF), mint jól -bevált membránelválasztási technológiát, széles körben alkalmazzák az mRNS-gyártásban a nagy-hatékonyságú molekuláris szűrési képessége, a szabályozható puffercsere és az alacsony nyírófeszültség jellemzői miatt. A membránmodulok kialakítása alapján a gyakori TFF konfigurációk közé tartoznak a lapos-lapkazetták és az üreges-szálas modulok. Ezenkívül a TFF-ben a nyomással -vezérelt membránszétválasztás a membrán pórusmérete szerint mikroszűrésre (MF), ultraszűrésre (UF), nanoszűrésre (NF) és fordított ozmózisra (RO) sorolható, fokozatosan növekvő szelektivitással.
A TFF kritikus szerepet játszik az mRNS gyógyszergyártás több szakaszában, ideértve a plazmid DNS tömeg előállítását, az mRNS tömegtermelését és az mRNS-LNP gyógyszertermékek végső formálását. A membrántípus, a molekulatömeg-levágás{1}}(MWCO) és a membránanyag megfelelő megválasztásával a TFF hatékonyan távolítja el a reakcióban keletkező melléktermékeket- és a kis-molekulatömegű-szennyeződéseket, ugyanakkor megkönnyíti a puffercserét és a koncentrációt az LNP kapszulázása előtt és után egyaránt. Ez jelentősen javítja az RNS tisztaságát, stabilitását és az általános folyamat méretezhetőségét.
Ezenkívül a tangenciális áramlási szűrés teljesítményét befolyásolják a rendszer konfigurációs tényezői, például a szivattyú típusa és a csövek kialakítása, valamint a legfontosabb folyamatparaméterek, beleértve a transzmembrán nyomást (TMP), a nyírófeszültséget és a szűrési fluxust. Ezeket a tényezőket gondosan kell kiválasztani és optimalizálni a céltermék jellemzői alapján, különösen a stressz-érzékeny termékek, például az mRNS–LNP esetében, amelyek a feldolgozás során nagyon érzékenyek a külső mechanikai erőkre.
A plazmid DNS tisztítása
A plazmid DNS törzsoldat elkészítése alapvetően a transzkripciós templát szekvencia tervezésén alapul. Az előállítási módszerek jellemzően plazmid DNS-amplifikációt tartalmaznak, bár PCR-amplifikáció is használható. Példaként a DNS-amplifikációt tekintve, megtervezettE. coligyakran használják fermentációs{0}}alapú erősítéshez. A downstream tisztítási folyamat főként sejtgyűjtést, lízist és derítést, koncentrálást és puffercserét, steril szűrést, linearizálást és kromatográfiás tisztítást foglal magában. Ipari körülmények között a folyamatos-áramlásos centrifugálást gyakran alkalmazzák sejtgyűjtésre, de ez viszonylag nagy nyíróerőt generál. Az üreges rostrendszerek nyitott csatornáikkal és alacsony nyíróerővel alkalmasabbak nagy szilárdanyag-tartalmú, nagy viszkozitású vagy nyírási érzékenységű minták, például plazmid DNS kezelésére. Az összegyűjtés után a sejteket nagynyomású homogenizálásnak, ultrahangos kezelésnek vagy lúgos lízisnek vetik alá, majd mélységi szűréssel előzetes derítésnek vetik alá.
A későbbi kromatográfia megkönnyítése érdekében a koncentráláshoz és a puffercseréhez gyakran először tangenciális áramlási szűrést (TFF) alkalmaznak membránkazettákkal vagy üreges szálas oszlopokkal, 30 kDa, 100 kDa vagy 300 kDa molekulatömeg-csökkentéssel. Ez csökkenti a minta térfogatát, miközben egyidejűleg eltávolít néhány szennyeződést, például RNS-t, gazdasejt fehérjéket (HCP) és gazdasejt DNS-fragmenseket (HCD). A kromatográfia szolgál a mag tisztítási lépéseként. Az anioncserélő kromatográfiát (AEX) jellemzően hidrofób interakciós kromatográfiával (HIC) kombinálják, hogy hatékonyan eltávolítsák a szennyeződéseket és gazdagítsák a nagy bioaktív szuperspirált plazmid DNS-t, ezáltal jelentősen javítva a plazmid tisztaságát.
A tisztítás után a plazmidot ismét TFF-nek vetjük alá, hogy az oldatot a célkoncentrációra (általában 0,5-2 mg/ml) koncentráljuk, és a végső tárolópufferrel dialízist hajtsunk végre. Ez a lépés eltávolítja a maradék sókat és szerves oldószereket a folyamatból, biztosítva, hogy a pufferrendszer megfeleljen a downstream in vitro transzkripciós (IVT) reakciók követelményeinek.
In vitro átírt (IVT) mRNS tisztítása
Az in vitro transzkripció (IVT) és a módosítás az mRNS törzsoldatok készítésének kulcsfolyamatai. Az IVT mRNS termelése során tangenciális áramlási szűrés (TFF1) – kromatográfia – tangenciális áramlási szűrés (TFF2) kombinációját alkalmazzák. Ez a stratégia biztosítja az mRNS hatékony és jó minőségű-tisztítását, és kritikus támogatást nyújt a vakcinagyártáshoz.
A transzkripciós és módosítási reakciók befejeződése után általában először ultraszűrést/diafiltrációt hajtanak végre membránkazetták vagy üreges szálas oszlopok segítségével, amelyek molekulatömeg-lezárása 30 kDa, 100 kDa vagy 300 kDa. Ez a lépés hatékonyan távolítja el a reakciórendszerből a különféle folyamatokkal összefüggő szennyeződéseket, mint például az RNS-polimerázt, a maradék DNS-fragmenseket, az el nem reagált NTP-ket, a záró enzimeket, a kettős{6}}szálú RNS-t (dsRNS) és a kis{7} molekula inhibitorokat, miközben egyidejűleg puffercserét is végrehajt. Egyetlen érintőleges áramlású szűrési lépés után a legtöbb szennyeződés hatékonyan eltávolítható, és az egyetlen kimutatható maradék fehérjeszennyeződés az RNS-polimeráz.
Ezt követően többszörös kromatográfiás technikákat alkalmaznak a további tisztításhoz. Az általánosan használt módszerek közé tartozik az affinitáskromatográfia, a méret-kizárásos kromatográfia, az ion-pár fordított-fázisú kromatográfia és az ion-cserés kromatográfia. Az ultraszűrés és a szekvenciális kromatográfia ezen kombinációja révén az mRNS magas tisztasági szintet ér el.
A formulázási vagy tárolási követelmények teljesítése érdekében az mRNS törzsoldatot ismét koncentráljuk vagy hígítjuk 30 kDa, 100 kDa vagy 300 kDa membránkazettákkal vagy üreges rostoszlopokkal, hogy pontosan beállítsuk a célkoncentrációt, és kicseréljük a végső készítménypufferbe. Végül steril-minőségű szűrést alkalmaznak a mikrobiális terhelés szabályozására, ezzel befejezve az anyag ideiglenes tárolását és feltöltését.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
Az mRNS{0}}LNP készítmények tisztítása
A lipid nanorészecskék (LNP-k) jelenleg az mRNS terápiás szerek legszélesebb körben tanulmányozott szállítórendszerei. Jelenleg a különböző mRNS{1}}LNP-készítmények a preklinikai és klinikai fejlődés különböző szakaszaiban vannak. Az LNP-k nagyon érzékenyek a gyártási folyamatokra. Az mRNS-LNP előállításához szükséges egységműveletek közül jelentős kihívást jelent a koncentráció és a puffercsere tangenciális áramlási szűréssel (TFF), valamint a steril szűréssel. Ezeket a lépéseket gondosan optimalizálni kell, hogy biztosítsák a folyamat méretezhetőségét és a termékminőséget, miközben elkerülik az olyan problémákat, mint a membrán eltömődése és a szűrő helytelen betöltése.
Az mRNS kapszulázását követően tangenciális áramlási szűrést (TFF) alkalmazunk a tisztításhoz. Ennek a lépésnek a célja a kapszulázatlan mRNS, a szabad polimerek vagy lipid anyagok, valamint a maradék oldószerek eltávolítása az mRNS-ből és a lipidekből. Mivel az mRNS-LNP-k szobahőmérsékleten korlátozott stabilitást mutatnak, a későbbi folyamatok, köztük a TFF optimalizálása kritikus fontosságú a termékminőség megőrzése szempontjából.
A legfontosabb optimalizálási irányok a következők: a transzmembrán nyomás (TMP) és a tangenciális áramlási sebesség megfelelő beállítása az mRNS{0}}LNP-k részecskemérete és stabilitása alapján a szűrési hatékonyság és a részecskefeszültség egyensúlya érdekében; membránok vagy üreges szálas oszlopok kiválasztása megfelelő molekulatömeg-levágással (MWCO, pl. 100 kDa vagy 300 kDa) a szabad mRNS, a szennyeződések és a cserepuffer hatékony eltávolítása érdekében, miközben minimalizálja a részecske adszorpcióját vagy károsodását; és a koncentráció és a diafiltrációs térfogat optimalizálása, hogy biztosítsák a hatékony puffercserét a célkészítménybe, és szabályozzák a végső részecskekoncentrációt és diszperzitást.
Ezenkívül a kritikus minőségi jellemzőket (például a részecskeméretet, a polidiszperzitási indexet [PDI] és az mRNS-kapszulázási hatékonyságot) szorosan figyelemmel kell kísérni a folyamat során, és a paramétereket a valós idejű adatok alapján dinamikusan módosítani kell az mRNS{1}}LNP-k stabil, méretezhető és hatékony tisztítása és formulálása érdekében.
Ezen túlmenően, az mRNS{0}}LNP-k és komponenseik instabilitása miatt a terminális sterilizációs eljárások során, általában 0,2 µm-es steril-minőségű szűrőt használnak a baktériumok és más mikrobiális szennyeződések eltávolítására.