Rövid megbeszélés az üreges rostok számos egyedi módszeréről a zárványtest-tisztításban

Az inkluzív testek (IB) nagy sűrűségű, oldhatatlan fehérjerészecskék, amelyek membránokba vannak burkolva, amikor idegen gének expresszálódnak prokarióta sejtekben, különösen Escherichia coliban. Mikroszkóp alatt megfigyelve az IB egy nagy fénytörésű régió, amely nyilvánvalóan különbözik a citoplazma többi komponensétől.

A zárványtest képződése viszonylag összetett, a citoplazmában történő fehérjetermelés sebességéhez kapcsolódik, az újonnan keletkező peptidek koncentrációja magas, és nincs elég idő a feltekeredésre, hogy amorf fehérje aggregátumok képződjenek. A zárványtestek alapvetően fehérjékből állnak, amelyeknek több mint 50%-a klónozott termék. Ezeknek a termékeknek az elsődleges szerkezete teljesen helyes, de a háromdimenziós konfiguráció hibás, így nincs biológiai aktivitás. A zárványtest mérete 05-1μm, vízben nem oldódik, csak denaturálószerekben, például karbamidban, guanidin-hidrokloridban stb.

Az E. coliban a zárványtestek a sejt két helyén fordulhatnak elő: a citoplazmában és a perifériás citoplazmában. A zárványtestek elhelyezkedése és jellemzői a sejtben a fehérjék expressziójának módjától függenek.

Az E. coli citoplazmájában lévő zárványok átmérője általában {{0}},2 és 1,5 μm között van, és a különböző fehérjék átmérője eltérő, például az interferon mérete 0,811 μm, A prorennet mérete 1,281 μm. Egyes esetekben egyes zárványtestek átmérője nagyobb, mint az E. coli átmérője, ami az E. coli kiemelkedését eredményezi. Általában egy sejtnek csak egy zárványteste van.

 

A zárványtest tisztítása

 

A zárványtest tisztítási folyamata általában a következő:

Sejtzúzás:

A sejtaprítás általános technológiája: nagy sebességű szövetzúzás, üveghomogenizáló homogenizálás, ultrahangos kezelés, ismételt fagyasztás-olvasztás módszer, vegyszeres kezelés (általában lizozim kezeléssel).

 

Inkluzív testmosás:

A zárványtestek inaktív szilárd részecskék, amelyek a baktériumok által expresszált fehérjék intracelluláris agglutinációjával képződnek, és amelyek általában amorf, oldhatatlan formában léteznek. A zárványtestben a valódi célfehérje csak körülbelül 50%-ot tesz ki, a többi pedig lipideket, lipopoliszacharidokat, nukleinsavakat és heteroproteineket tartalmaz, amelyek a zárványtesthez kötődnek, és befolyásolják a zárványtest fehérje renaturálódását. Ezért a denaturálás előtti mosás nagyon szükséges lépés.

Ezen túlmenően, a zárványtestek mosása segít a rekombináns fehérjék újrahajtogatási hozamának növelésében. A szennyeződések eltávolításával csökkenthetők a renaturációs folyamat akadályai, így a fehérje hatékonyabban hajtogatható és helyesen összeállítható, javítva ezzel a fehérje aktivitását és működését.

A mosáshoz általában kevesebb, mint 1%-ban használnak semleges mosószert, mint például Tween, Triton, Urea és NP40 plusz EDTA és redukálószerek 2-merkapotreitol (DTT), -merkaptoetanol, többször megismételve, mert a mosószer mosási kapacitása megnő az oldat ionerősségének növelése, zárványtestek mosásánál NaCl-t adhatunk az ionerősség növelésére.

A zárványtestek a sejtlebontó oldat egyéb komponenseinek centrifugálással vagy szűréssel történő eltávolítására használhatók, amelyek mindegyike kihasználja a zárványtestek eltérő fizikai tulajdonságait.

 

Centrifugálás:

A zárványtest fehérjék sokkal sűrűbbek, mint az azonos térfogatú sejtfragmensek, így a zárványtest centrifugálással elválasztható a sejt többi részétől. Az ipari termelésben a zárványtestek előállítására a folyamatos centrifugálás a leggyakrabban alkalmazott művelet. Mivel a sejtfragmensek sűrűsége kisebb, mint a zárványtesté, az ülepedési sebesség kisebb, mint a zárványtesté. A folyamatos szuszpenzió és centrifugálás a zárványtest nagy részét centrifugálhatja, miközben a sejtfragmensek fokozatosan eltávolíthatók.
Szűrés (tangenciális áramlású szűrés) : A zárványtestek és az oldható fehérjék eltérő molekulamérete miatt alkalmazható a szűrés módja, amellyel csökkenthetők az üzemeltetési költségek, és egyszerű a méretezhetőség. A tangenciális áramlási szűrést (TFF) a transzmembrán nyomáskülönbség hajtja. A membrán pórusméreténél kisebb anyagok és szennyeződések áthaladnak a membránon, míg a szennyeződések, például a nagyobb részecskéket tartalmazó sejtek beszorulnak. A szűrőmosáshoz általában használt membránnyílás 0,1 μm. Az üreges szál tangenciális áramlású mikroszűrése közvetlenül megbirkózik a folyékony anyag magas szilárdanyag-tartalmával, kevesebb lépéssel, egyszerű kezeléssel, a membrán ismételten használható a tisztításon keresztül, csökkentve a berendezések beruházási és üzemeltetési költségeit, összhangban a moduláris automatizált gyártás követelményeivel.

 

A következő egy alkalmazási eset a zárványtest mosására Guidling üreges szálas oszlopokkal.

94 cm2 0.1-0,45 μm-es üreges szálat használtunk 250 ml folyadék (célfehérje molekulatömege 17 kd) koncentrálásához. A teljes mosási folyamat során a célfehérje visszanyerési sebességét és a membrán fluxus kimerülését vizsgáltuk.

A 0-71min a koncentrálási folyamat, a 71-224min a mosási és szűrési folyamat. A teljes mikroszűrési folyamat során a TMP fokozatosan nőtt, a folyadék bemeneti sebessége változatlan maradt, és az átlagos anyagáram 12LMH volt.

Az eredmények azt mutatták, hogy a célfehérje teljesen csapdába esett, és a célfehérje visszanyerési aránya több mint 90%. A vezető üreges szálas oszlopok stabilak és alkalmasak erre az alkalmazásra.

 

Zárványtest feloldódása:

A zárványtesteket általában karbamid vagy guanidin-hidroklorid denaturálószerrel oldják fel, és az oldott zárványtest fehérjék teljesen denaturálódnak, azaz az elsődleges szerkezet és a kovalens kötések megtartása kivételével minden hidrogénkötés és hidrofób kötés megsemmisül, és hidrofób oldalláncok teljesen szabaddá válnak.

A karbamid és a guanidin-hidroklorid közepes erősségű denaturálószerek, amelyek dialízissel és ultraszűréssel könnyen eltávolíthatók. A karbamid általános koncentrációja 8-10M, guanidin-hidroklorid 6-8M. A karbamid oldásának előnye, hogy nem ionizál, semleges, olcsó, a renaturáció utáni fehérje eltávolítása nem okoz nagy mennyiségű fehérje kicsapódást, az oldott zárványtestek pedig különféle kromatográfiás módszerekkel tisztíthatók, ezért széles körben alkalmazzák. .

 

A zárványtest fehérje újratekerése:

Az oldott rekombináns fehérjét megfelelően hajtogatni kell, hogy funkcionális fehérjét képezzen. A renaturálás technikái közé tartozik a fehérjeoldat közel semlegesre hígítása, a denaturálószer eltávolítása, az oszlopon történő renaturálás és a gélszűrős kromatográfia. Közülük a fehérjeoldat közel semlegesre hígítása és a denaturálószer eltávolítása elterjedt klasszikus renaturációs módszer, különösen a hígításos renaturáció a legmagasabb felhasználási arány.

Denaturálószer eltávolítása:

Dialízis: Előnye, hogy a térfogat nem növekszik, a denaturálószer eltávolítási sebességét pedig a külső permeábilis folyadék koncentrációjának fokozatos csökkentésével szabályozzuk, de hosszú ideig tart és könnyen képződik inaktív fehérje aggregátum, ami nem alkalmas nagyszabású működés, és nem alkalmazható a termelési léptékre.

Ultraszűrés (TFF): könnyen szabályozható a dialízis sebessége, legyen szó kutatásról és fejlesztésről, kísérleti tesztről vagy gyártásról, ultraszűréssel (TFF) távolíthatja el a denaturáló anyagokat (folyadékcsere + koncentráció).

 

Inkluzív test fehérje tisztítása:

A renaturálás utáni fehérjetisztítás módszerei hasonlóak az oldható fehérjék tisztításához, nevezetesen ioncserélő kromatográfia, gélszűrős kromatográfia, affinitáskromatográfia, ammónium-szulfátos kisós kicsapás stb.

A zárványtesteknek nincs biológiai aktivitásuk, nem kell aggódni a fehérjeaktivitás elvesztése miatt, és a nagy mennyiségű expresszió nem vezet sejthalálhoz, és maximalizálja a proteáztámadással szembeni ellenállást. A Jiuling üreges szál rugalmasan alkalmazható a zárványtestek downstream tisztítási folyamatában. Az inklúziós test mosási lépésében a centrifugális mosáshoz képest kiváló teljesítmény, a kilenc éves technológiájú mikroszűrő üreges szálak tangenciális áramlású szűrőmosáshoz történő alkalmazása nagymértékben lerövidítheti a folyamat idejét, és az általános visszanyerési arány elérheti a 90% -ot. A Jiuling üreges szál a zárványtestek fehérje renaturációs lépésében is használható. A mikroszűrő üreges rosttal szűrt tápfolyadék zavarossága jelentősen csökken, és a fehérje visszanyerési sebessége magas; Az ultraszűrő üreges szálak használata nemcsak a denaturáló anyagokat távolíthatja el, hanem lerövidítheti a kromatográfiás minta betöltési idejét is, hogy időt takarítson meg, csökkentse a töltőanyag mennyiségét és csökkentse a gyártási költségeket. A mikroszűrés/ultraszűrés üreges szálak visszanyerési sebessége a különböző anyagoktól függően változik, és az általános visszanyerési arány elérheti a 90-95%-ot.

A Guidling Technology örömmel várja, hogy tesztkészleteket kérjen a kapcsolódó felülvizsgálatokhoz.

 

Guidlingről

A Guidling Technology egy nemzeti csúcstechnológiai vállalkozás, amely a biogyógyszerekre, a sejttenyésztésre, a biomedicina tisztítására és koncentrálására, a diagnózisra és az ipari folyadékokra összpontosít. Sikeresen fejlesztettünk centrifugális szűrőeszközöket, ultraszűrő és mikroszűrő kazettákat, vírusszűrőket, TFF rendszereket, mélységi szűrőket, üreges szálakat stb. Amelyek teljes mértékben megfelelnek a biogyógyszerek, a sejttenyésztés és így tovább. Membránjainkat és membránszűrőinket széles körben használják az előszűrés, a mikroszűrés, az ultraszűrés és a nanoszűrés koncentrálására, extrakciójára és szétválasztására. Számos termékcsaládunk, a kisméretű, egyszer használatos laboratóriumi szűréstől a gyártási szűrőrendszerekig, a sterilitásvizsgálaton, a fermentáción, a sejttenyésztésig és még sok másig megfelel a tesztelés és a gyártás igényeinek. A Guidling Technology már várja, hogy együttműködjön Önnel!