Lefelé irányuló ultraszűrési/diafiltrációs töményítési folyamat: Hogyan lehet hatékonyan megakadályozni a célfehérje átszivárgását és elvesztését

Utólagos ultraszűrési/diafiltrációs koncentrálási folyamat: Hogyan lehet hatékonyan megakadályozni a célfehérje behatolását és elvesztését

A rekombináns fehérjék, vértermékek és más biológiai anyagok utáni tisztítási folyamataiban az ultraszűrést/diafiltrációt (UF/DF) használják az alapanyag koncentrálására, a puffercserére, valamint a sók és a kis molekulájú szennyeződések eltávolítására. Az elválasztás a membránszűrőn alapul: a nagy molekulákat, például a monoklonális antitesteket (mAb-k) visszatartja a membrán, míg a sók, endotoxinok, szabad gazdasejtfehérjék (HCP-k) és más kis -molekulájú szennyeződések áthaladnak a membránon, és a permeátumban távoznak. A folyamat-nagyobbítása során könnyen előfordulhat a membránon keresztüli célfehérje-vesztés, ami közvetlenül csökkenti a hozamot és növeli a tételköltségeket. Egyes működési körülmények között a fehérje kimutatható a permeátumban, amihez gyorsan meg kell határozni, hogy a kiszivárgott komponensek sértetlen cél mAb-ek, degradált/fragmentált aggregátumok vagy gazdasejtfehérjék. Ez a cikk két nagy részre oszlik: áttekinti a hagyományos folyamatszabályozási{7}megközelítéseket, és a Design of Experiments (DOE) funkcióval kombinálva egy robusztus folyamatablakot hoz létre, amelyet számos analitikai módszer támogat a permeátumban kimutatott fehérjék azonosításának meghatározására.

 

 

I. Az UF/DF során a membránon keresztüli célfehérje-permeáció fő okai

1. Túlzott transzmembrán nyomás (TMP)
Ha a membránon átívelő nyomáskülönbség túl nagy, az oldószer ellenállása megnövekszik, ami bizonyos monomer fehérjéket kényszerít a permeátumba. A méretnövelés során- a betápláló tartály nagyobb mennyiségű anyagot tartalmaz, és a nyomásingadozások a csővezetékekben kifejezettebbek, így nagyobb az átmeneti túlnyomás valószínűsége, mint laboratóriumi méretekben.

2. Nem megfelelő tangenciális áramlási sebesség
Ha az áramlási sebesség túl alacsony, sűrű koncentrációjú-polarizációs réteg képződik a membrán felületén, és a helyi fehérjekoncentráció meghaladhatja a membrán tűrésküszöbét. Ha az áramlási sebesség túl nagy, a nyírófeszültség az mAb szerkezeti hasadását okozhatja, kisebb fehérjefragmenseket hozva létre, amelyek szabadon áthaladhatnak a membrán pórusain.

3. Túl magas fehérjekoncentráció az alapanyagban
Ha a takarmányban túl magas a fehérjekoncentráció, a fehérje felhalmozódik a membrán felületén, és egy kis monomer fehérje bejuthat a permeátumba. Ez gyakori probléma a nagyszabású-termelésben.

4. pH vagy vezetőképesség az eljárási tartományon kívül
A fehérje töltési jellemzőiben bekövetkező változások csökkenthetik annak hidratációs sugarát és látszólagos részecskeméretét, ami abnormális membránpermeációt eredményez.

5. A membránkazetta elöregedése, nagy diffúziós fluxus vagy elégtelen elő-kondicionálás
A membránkazetta fizikai hibái közvetlenül fehérjeszivárgást okozhatnak, és a berendezéssel kapcsolatos{0}}kockázatot jelentenek. Az erősen lúgos oldatokkal végzett ismételt CIP fokozatosan károsíthatja a poliéterszulfon (PES) membrán anyagát.

6. Túl nagy diafiltrációs térfogat
Hosszan tartó diaszűrés során a folyamatos oldószeres öblítés kis mennyiségű monomer fehérjét fokozatosan elvezethet.

 

II. Hagyományos gyakorlati intézkedések a célzott fehérje-átszivárgás és -veszteség megelőzésére

(A) Folyamatparaméter-vezérlés

1. A transzmembrán nyomás (TMP) szabályozása
Határozzon meg egy felső nyomásfigyelmeztetési határt, és hozzon létre reteszelő riasztásokat, hogy megakadályozza a membránrétegre gyakorolt ​​átmeneti nagy nyomás{0}}hatásokat. Az alapparaméterek kis léptékben történő meghatározása után csökkentse a biztonságos üzemi nyomást a termelés léptékesítése során, és tartson fenn egy megfelelő folyamattűrési tartományt.

2. Optimalizálja a keresztáramlási sebességet
Hozzon létre egy stabil határréteget, és csökkentse a koncentráció polarizációt a membrán felületén keresztáramláson keresztül, ezáltal minimalizálva a fehérje felhalmozódását a membrán felületén a forrásnál.

3. A koncentrálás után korlátozza a végső koncentrációt
A fehérje fizikai-kémiai tulajdonságai alapján határozzon meg egy koncentrációs határt, és kerülje a túlzott takarmánykoncentrációt. Az mAb-k esetében a szokásos végkoncentráció általában nem haladja meg az 50 mg/ml-t; egyes aggregációra hajlamos{2}} monoklonális ellenanyagok esetében a koncentrációt tovább kell csökkenteni.

4. Szabályozza a takarmány pH-értékét és vezetőképességét
Tartsa fenn a fehérje stabil hidratált részecskeméretét, és kerülje a sav/bázis vagy az ionos -erősség zavara által okozott molekuláris összehúzódást.

(B) Berendezések és kezelőszervek

1. Minden egyes tétel előtt végezze el a membránkazetta integritásának vizsgálatát
Minden egyes tétel gyártása előtt végezzen buborék{0}}pontos tesztet, hogy azonosítsa a törött membránszálakat. A sérült membránkazettákat azonnal ki kell dobni a folyamatos fehérjeszivárgás elkerülése érdekében.

2. Szabványosítsa a CIP tisztítási eljárást
Szabályozza a NaOH koncentrációt és az érintkezési időt. Erősen lúgos tisztítás után teljesen kiegyensúlyozza a membrán anyagát, hogy csökkentse a membránpórusok deformációjának kockázatát.

3. Használjon fokozatos diafiltrációt
Használjon nagy mennyiségű puffercserét a korai szakaszban a sók eltávolítására, és a végpont közeledtével lassítsa le a diafiltrációs áramlási sebességet, hogy csökkentse a fehérje ellenállását és veszteségét.

 

III. Folyamattervezési terület létrehozása a DOE-n keresztül (QbD folyamatjellemzés; IND benyújtásra vonatkozik)

1. Faktorszűrés
Szűrje le az öt kulcsfontosságú UF/DF folyamatparamétert (P): transzmembrán nyomás, betáplálás áramlási sebessége, kezdeti fehérjekoncentráció, betáplálás pH-ja és működési hőmérséklete.
Válaszváltozók: megtartott hozam, fehérjetartalom a permeátumban, membránfluxus és a nagy -molekula-tömegű aggregátumok százalékos aránya.

A szignifikanciaelemzés segítségével azonosítsa azokat a kulcsfontosságú tényezőket, amelyek hozzájárulnak a fehérjeszivárgáshoz.

2. Válaszfelület-modellezés
Válassza ki a négy legnagyobb jelentőségű paramétert a válaszfelület felépítéséhez és a paraméterek közötti kölcsönhatások elemzéséhez. Számos működési körülmény között előfordulhat, hogy egyetlen paraméter a megfelelő tartományon belül marad, míg két paraméter kombinációja fehérje permeációt eredményezhet. Az ilyen interakciós hatások nem azonosíthatók a hagyományos egy-tényező-egyszeri--kísérletekkel. A modell alapján határozzon meg egy működőképes tervezési teret. Mindaddig, amíg a folyamat paraméterei ezen a tartományon belül maradnak, hatékony fehérje-visszatartás biztosítható, miközben a szennyeződéseket diaszűréssel eltávolítjuk.

3. Legrosszabb-eseti kihívás (a folyamat jellemzéséhez szükséges)
A gyártási változékonyság szimulálásához válassza ki a folyamatparamétereket a működési határok szélső pontján: maximális TMP, minimális keresztáramlási sebesség és felső{0}}fehérjekoncentráció. Győződjön meg arról, hogy még szélsőséges működési körülmények között sem fordul elő nagy-mértékű célfehérje-veszteség, így teljesíti a CMC felülvizsgálati követelményeit.

 

IV. Többféle analitikai módszer a permeátumban kimutatott fehérjék azonosítására, valamint a cél mAb, a degradációs fragmensek és a HCP megkülönböztetésére

Az elemzési hatékonyság, a költségek és a hatósági benyújtási forgatókönyvek alapján a módszerek két kategóriába sorolhatók: gyorsszűrés és megerősítő tesztelés. A gyors módszereket prioritásként kell kezelni a folyamatok rutin monitoringja során; kóros eltérések esetén pontos azonosítási módszereket kell alkalmazni.

1. UV-spektrofotometria (gyors online szűrés; rutin bolti{1}}padlófigyeléshez előnyös)
Gyűjtsük össze a permeátumot, és mérjük meg az A280 abszorbanciáját. Ez csak azt tudja meghatározni, hogy fehérje van-e a permeátumban, és nem tudja megkülönböztetni a fehérjefajtákat. Főleg rutin folyamatfelügyeletre használják. A folyamatosan növekvő A280 érték romló fehérjeszivárgást jelez, és a diaszűrés azonnali felfüggesztését és a folyamat vizsgálatát teszi szükségessé.

2. SDS-PAGE elektroforézis (leggyakrabban használt kvalitatív azonosítási módszer)
Használjon redukáló és nem{0}}redukáló elektroforézist, és hasonlítsa össze a sávok pozícióit a nyersanyagban lévő cél mAb pozícióival:
1) Ha a sáv helyzete teljesen összhangban van a megcélzott mAb-vel, akkor az érintetlen mAb átjárta a membránt.
2) Ha kisebb-molekula-tömegű sávok jelennek meg, a fehérje hidrolitikus hasításon ment keresztül, ami mAb-fragmenseket eredményez.
3) Ha a sávok több különböző sávval vannak szétszórva, akkor a legtöbb E. coli/CHO gazdasejtekből származó gazdasejtfehérje (HCP), nem pedig a céltermék.

3. Nagy-teljesítményű méret-kizárásos kromatográfia (HPSEC)
A komponenseket molekulaméret szerint különítse el, és hasonlítsa össze az elúciós idejüket a nyersanyag-kromatogramon lévőkkel:
- Az mAb-éval azonos retenciós idejű főcsúcs érintetlen célfehérjét jelez.
- A korábban eluálódó csúcs nagy-molekula-tömegű aggregátumokat/fragmenseket jelez.
- A később eluálódó csúcs kis-molekulatömegű-degradációs fragmentumokat jelez.
- A jellegzetes főcsúcs hiánya HCP-szennyező fehérjéket jelez.
Ez a módszer kvantitatív adatokat szolgáltathat, és beépíthető a folyamateltérések vizsgálati jelentésébe; nagy az elfogadottsága a klinikai benyújtási anyagokban.

4. HCP gazda-sejtfehérje ELISA kit tesztelése
Ha fehérjét mutatnak ki a permeátumban, az ELISA-eredmény megemelkedett, és a HPSEC nem mutat jellegzetes mAb-csúcsot, akkor a kiszivárgott anyag alapvetően CHO-gazdasejt-fehérjéknek tekinthető. Ez a szennyeződések nem teljes eltávolítását jelzi az upstream tisztítás során; a szennyeződések az UF/DF szakaszban kimosódnak, és nem jelentenek termékveszteséget.

5. Affinitáskromatográfiás ellenőrzés (Protein A kromatográfia)
Az A protein specifikusan kötődik a mAb Fc régiójához. Helyezze a permeátummintát az oszlopra: a jellegzetes elúciós csúcs megjelenése érintetlen célantitest jelenlétét jelzi; az elúciós csúcs hiánya azt mutatja, hogy a permeátumban lévő fehérjék mind szennyezett fehérjék.

6. Tömegspektrometria (LC-MS) (mélységi nyomon követhetőség; főbb folyamateltérések vizsgálatára használják)
Az LC-MS képes közvetlenül elemezni az aminosavszekvenciát, és pontosan meghatározni a fehérje eredetét. Főleg nehéz vagy szokatlan eltérések kivizsgálására használják, és nem rutinszerű-folyamat-ellenőrzési tesztként.

V. A különböző elemzési eredményeknek megfelelő korrekciós intézkedések

1. Intakt target mAb-t észleltünk a permeátumban
Csökkentse a transzmembrán nyomást és a koncentrálás utáni végső koncentrációt; szűkítse a folyamat működési tartományát a DOE eredmények alapján; és ellenőrizze a membránkazetta integritását.

2. A permeátumban kimutatott antitest-degradációs fragmentumok
Vizsgálja meg a nyírófeszültséget az egész folyamat során és a szélsőséges pH-értékeket; optimalizálja az upstream vírusinaktiválási lépést a fehérjehasadás csökkentése érdekében.

3. A permeátumban csak a HCP szennyező fehérjéket detektáltuk
Az UF/DF paraméterek módosítása nem szükséges. Kövesse vissza a problémát az előző kromatográfiás lépésekre, és javítsa a szennyeződések eltávolítását az affinitás- és ioncserélő kromatográfia során.

 

VI. Összegzés

Az UF/DF során előforduló fehérjeszivárgás megelőzése érdekében a hagyományos folyamatvezérlés a múltbeli tapasztalatokra támaszkodik az egyedi pontparaméterek meghatározásakor, amelyek csak a stabil, kis léptékű termelést tudják megfelelően kezelni. A stabil teljesítmény biztosítása érdekében a lépésenkénti folyamatskálázás-felépítése során a DOE-alapú folyamatjellemzést kell használni a megfelelő tűréshatárral rendelkező folyamattervezési tér kialakításához. Az intervallum-alapú paramétervezérlés kompenzálhatja a gyártási változékonyságot. Miután a fehérjét kimutatták a permeátumban, egy egyszerű UV-érzékelő rendszer kezdeti figyelmeztetést adhat, amelyet elektroforézis, HPSEC és ELISA követ a nyomon követhetőség és azonosítás érdekében. Ez lehetővé teszi a pontos különbségtételt a céltermék és a gazdasejt-szennyeződések között, lehetővé téve a célzott gyökér--okok kivizsgálását és a korrekciós intézkedéseket. Ez is egy szabványosított kutatási komponens, amely jelenleg az mAb projektek CMC dokumentációjában szerepel.