Ultrafiltráció alkalmazása természetes kollagén extrakcióban

A kollagén, mint természetes fehérjeforrás jó biokompatibilitású, alacsony antigenitású, biológiailag lebontható és vérzéscsillapító képességgel rendelkezik, feszes spirális szerkezete és saját jellemzői vannak, amelyek mind előfeltételei iparosodásának. A kollagént és melléktermékeit nem csak csomagolóanyagként, kozmetikai és egészségügyi termékként használják, hanem élelmiszer-adalékanyagként is használják a húskészítmények javítására, és különösen az orvostudományban játszik fontos szerepet.

 

Mi az a kollagén?

 

A kollagén egy biológiai makromolekula, az állati kötőszövet fő alkotóeleme, valamint az emlősökben a legelterjedtebb és legszélesebb körben elterjedt funkcionális fehérje, amely a teljes fehérje 25-30%-át teszi ki, sőt egyes szervezetekben akár 80%-ot vagy még többet is. Az állati sejtekben a kötőszövet szerepét tölti be.

A mérések szerint egy felnőtt szervezetében körülbelül 3 kg kollagén található, amely főleg az emberi bőrben, csontokban, szemekben, fogakban, inakban, belső szervekben (beleértve a szívet, a gyomort, a beleket, az ereket) és az emberi test más részein található. funkciója a bőr és a szövetek, szervek morfológiájának és szerkezetének megőrzése, valamint fontos alapanyaga a különböző szövetek sérülés utáni helyreállításának.

 

Sokféle kollagén fehérje létezik, és a gyakori típusok az I, II, III, V és XI. Jó biokompatibilitása, biológiai lebonthatósága és bioaktivitása miatt a kollagént széles körben alkalmazzák az élelmiszeriparban, az orvostudományban, a szövettechnológiában, a kozmetikában és más területeken.

Hogyan lehet kivonni a természetes kollagént

Az állatállományból és baromfiból származó állati szövetek a fő módja annak, hogy az emberek természetes kollagénhez és kollagénpeptidjeihez jussanak. A kapcsolódó állatbetegségek és bizonyos vallási hiedelmek miatt azonban az emberek a szárazföldi emlősökből származó kollagént és termékeit korlátozottan használják, és a fejlődés fokozatosan a tengeri élőlények felé fordul. Az Európai Élelmiszerbiztonsági Hatóság (EFSA) megerősítette, hogy még az állati csontokból származó kollagén sem képes megfertőzni a kergemarhakórt és más kapcsolódó betegségeket. Az aminosav-összetétel és a térhálósodás mértékének különbségei miatt a vízi állatok, különösen a feldolgozási hulladékaikban gazdag kollagén, mint a bőr, a csont és a vízkő, számos előnnyel rendelkeznek, amelyekkel az állati kollagén nem rendelkezik. Ezenkívül a tengeri állatokból származó kollagén bizonyos szempontból nyilvánvalóan jobb a szárazföldi állatokból származó kollagénnél, például alacsony antigenitás és hipoallergén. Ezért a vízi kollagén fokozatosan helyettesítheti a szárazföldi állatok kollagénjét. Példaként szolgált az amur halpikkelyéből a kollagén kinyerésének folyamata.

 

Kollagén kinyerése amur halpikkelyéből ultrafiltrációs módszerrel

1. Anyagok és módszerek

1.1 Tesztminta

Nyers kollagén vizes kivonat.

1.2 Vizsgálati módszerek

1.2.1 Az ultraszűrési folyamat útja

 

1.2.2 A szűrés előtti folyamat meghatározása

Ebben a tesztben a vákuumszűrési módszert és a mikroszűrési módszert összehasonlítják és elemzik, hogy meghatározzák a legjobb szűrés előtti szűrési eljárást. A konkrét vizsgálati módszerek a következők:

① A nyers kollagénes vizes kivonatot szűrőpapír vákuumszivattyúzásával szűrtük, hogy eltávolítsuk a vizes kivonatban lévő szuszpendált részecskéket és szennyeződéseket.

② A nyers kollagénes vízkivonatot 0,2 μm-es mikroszűrő membránnal szűrtük, hogy eltávolítsuk az oldhatatlan anyagokat és a szennyeződéseket a vizes kivonatból.

 

1.2.3 Az ultraszűrő membrán pórusméretének kiválasztása

Az ultraszűrő membrán pórusmérete 100 kDa volt.

 

1.2.4 Ultrafiltrációs tisztítási eljárás egytényezős kísérlete

Ultrafiltrációs technológiát alkalmaztunk a nyers kollagén vízkivonat tisztítására, és egytényezős kísérleteket vizsgáltunk az üzemi nyomás, az üzemi hőmérséklet és a pH érték kollagénretencióra gyakorolt ​​hatásáról. Miután az ultraszűrő berendezést egy ideig beindították és stabilizálták, megvizsgálták a különböző tényezők kollagénretencióra gyakorolt ​​hatását.

 

1.2.5 Számítási képlet

 

2. Eredmények és elemzés

2.1 Az előszűrési folyamat elemzési eredményei

A két szűrési módszer, a vákuumextrakció és a mikroszűrés összehasonlítási eredményeit az alábbi táblázat tartalmazza.

 

A táblázatból látható, hogy mind a vákuum-, mind a mikroszűrési módszerrel eltávolíthatók az oldatban lévő szennyeződések és oldhatatlan szilárd anyagok, de a mikroszűrési módszer jobban védi a fehérjéket, vagyis a veszteség nem szembetűnő, és a vákuumszűrési módszer könnyen okozhat fehérjevesztést. Ezenkívül a vákuumszűrés a szűrlet egy ideig történő elhelyezése után zavarossá válik, és a mikroszűrő továbbra is tiszta és átlátszó, ezért az ultraszűrés előkezelési eljárásaként a mikroszűrést választják.

 

2.2 Ultraszűrési folyamat egytényezős tesztje

2.2.1. Az ultraszűrési nyomás hatása a visszatartási arányra

40 fokos hőmérséklet és pH=9.0 mellett a különböző ultraszűrési nyomások hatása (0.07MPa, {{9} }.09 MPa, 0,11 MPa, 0,13 MPa és 0,15 MPa) fehérje-visszatartást vizsgáltak. Az eredményeket az alábbi ábra mutatja.

Amint az a fenti ábrán látható, az üzemi nyomás növekedésével a fehérje-visszatartási arány fokozatosan csökken. Ha az üzemi nyomás {{0}}.07MPa, a fehérje-visszatartási arány 96,53%, ha pedig az üzemi nyomás 0,15 MPa, akkor a fehérje-visszatartási arány 84,38%. Ennek az az oka, hogy az ultraszűrés anyagokra gyakorolt ​​elválasztó hatását a nyomáskülönbség fejti ki. Alacsony üzemi nyomás tartományában a kis molekulák gyorsan átjutnak a membránon, míg a nagy molekulákat az ultraszűrő membrán megfoghatja és felhalmozódhat a membrán felületén. Ekkor a membrán felülete és a vízkivonat koncentrációkülönbséget képez, ami a koncentráció polarizációs ellenállását eredményezi. Jelenleg a nyomás viszonylag alacsony, és nem lehet nagy hatással a visszatartási arányra. A nyomás növekedésével azonban a koncentráció polarizációs ellenállása fokozatosan növekszik, és a membránfelület és a vízkivonat közötti koncentrációkülönbség egyensúlyba kerül. Ha a nyomás meghaladja ezt az egyensúlyt, a membrán felületén gélréteg képződhet (ami összhangban van azzal az elmélettel, hogy az ultraszűrés során koncentráció-polarizáció és kondenzációs réteg képződik), és a nyomás tovább növekszik, a gélréteg vastagsága nő. , és megnő a membrán felületén maradó fehérje mennyisége is. Ez alacsonyabb visszatartási arányt eredményez. A membrán elválasztó hatásának biztosítása érdekében az üzemi nyomás optimális paramétere 0,07 MPa.

 

2.2.2 A hőmérséklet hatása a fehérje-visszatartásra

{{0}},11 MPa nyomás és pH=9,0 mellett a különböző hőmérsékletek, nevezetesen 25 fok , 30 fok , 35 fok , 40 fok és 45 fok fehérjékre gyakorolt ​​hatása megtartását tanulmányozták. Az eredményeket az alábbi ábra mutatja.

Amint a fenti ábrán látható, az ultraszűrő membrán retenciós rátája fokozatosan növekszik a hőmérséklet emelkedésével, és 45 fokon éri el a maximumot, 97,01%-os retenciós rátával. Ennek az az oka, hogy a kollagén viszkozitása szorosan összefügg a hőmérséklettel. Alacsony hőmérsékleten a kollagén viszkozitása nagyobb, és a kollagén felhalmozódása a membrán felületén könnyen ellenállást képez, ami alacsony retenciós rátát eredményez. A hőmérséklet emelkedésével a kollagén viszkozitása csökken, a kollagénmolekulák közötti kölcsönhatás gyengül, és nő a tömegátadási sebesség, gyengül a koncentráció polarizációs jelenség, és nő a retenciós ráta. A retenciós arány növekedésének másik oka, hogy nő a hőmérséklet, ennek megfelelően nő a kollagén oldhatósága is, és csökken a kollagén membránblokkoló jelensége, így az ultraszűrés optimális hőmérséklete 45 fok.

 

2.2.3 A pH-érték hatása a fehérje-visszatartásra

{{0}},11 MPa nyomás és 40 fokos hőmérséklet mellett a különböző pH-viszonyok, nevezetesen pH=6.0, pH{{ 5}}.{{10}}, pH=8,0, pH=9,0 és pH=10,0, a retenciós rátát vizsgáltuk. Az eredményeket az alábbi ábra mutatja.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>A 7. ábrán a retenciós arány fokozatosan növekszik a pH-érték növekedésével. Ennek az az oka, hogy az ultraszűrő membrán negatív töltésű poliéter juhar membrán, a kollagén pedig lúgos körülmények között negatív töltésű. A negatív töltésű kollagénmolekulák az ultraszűrő membránnal azonos töltéssel egymást kizáró állapotot alkotnak, így a kollagénmolekulák nem könnyen maradnak a membrán felszínén és blokkolják a membránt. Ezért az ultraszűrés optimális pH-értéke 8-10.

 

2.3 Ultraszűrési folyamat optimalizálás és eredményellenőrzés

A Design-Expert8.05 szoftver elemzése szerint az optimális folyamatparaméterek: üzemi nyomás 0,14 MPa, üzemi hőmérséklet 40,98 fok, oldat pH{{7 }},43, a visszatartási arány pedig 92,551%. A tényleges paraméterek működőképességét figyelembe véve az ultraszűrési feltételeket 0,14 MPa üzemi nyomás, 40 fokos üzemi hőmérséklet és az anyagoldat 9,50 pH-értékeként választottuk meg, majd az ultraszűrő rendszer beindítása és stabilizálása után megkezdtük a vizsgálati ellenőrzést. A retenciós arány eredménye (92,61±0,1) % (n=3). Az egyenlet előrejelzett értékei alapvetően hasonlóak a mért értékekhez, ami azt mutatja, hogy az előre jelzett állapotparaméterek eredményei összhangban vannak a tényleges állapoteredményekkel.

 

2.4 Elektroforetikus elemzési eredmények

A tisztított kollagént SDS-PAGE elektroforézissel elemeztük, és az eredményeket a következő ábra mutatja.

 

Amint a fenti ábrán látható, az 1. sáv a teszt tisztított kollagénje, a 2. sáv pedig a borjúín standard kollagénmintája. Az SDS-PAGE elektroforézisből látható, hogy ebben a tanulmányban a kollagén kollagénként azonosítható, de úgy tűnik, hogy az a1 peptidlánc és az a2 peptidlánc közötti határok nem egyértelműek. Az elektroforetikus térképen látható, hogy nincs más fehérje szennyeződés, így megállapítható, hogy a tisztított kollagén nagy tisztaságú.

Guidlingről

 

A Guidling Technology egy nemzeti csúcstechnológiai vállalkozás, amely a biogyógyszerekre, a sejttenyésztésre, a biomedicina tisztítására és koncentrálására, a diagnózisra és az ipari folyadékokra összpontosít. Sikeresen fejlesztettünk centrifugális szűrőeszközöket, ultraszűrő és mikroszűrő kazettákat, vírusszűrőket, TFF rendszereket, mélységi szűrőket, üreges szálakat stb. Amelyek teljes mértékben megfelelnek a biogyógyszerek, a sejttenyésztés és így tovább. Membránjainkat és membránszűrőinket széles körben használják az előszűrés, mikroszűrés, ultraszűrés és nanoszűrés koncentrálására, extrakciójára és szétválasztására. Számos termékcsaládunk, a kisméretű, egyszer használatos laboratóriumi szűréstől a gyártási szűrőrendszerekig, a sterilitásvizsgálaton, a fermentáción, a sejttenyésztésig és még sok másig megfelel a tesztelés és a gyártás igényeinek. A Guidling Technology már várja, hogy együttműködjön Önnel!