Vírusszerű részecske oltás és annak downstream tisztítási folyamata
A vírusszerű részecske (VLP) oltás egy oltási technológia, amely a vírusszerkezeten alapul, de nem tartalmazza a vírusgenetikai anyagokat. Az erős immunválaszt stimulálják azáltal, hogy utánozzák a természetes vírusok morfológiáját és felszíni antigéneit, és nagyobb biztonságot nyújtanak, mivel nem képesek replikálódni. A VLP vakcinák jobb alternatívát jelentenek a hagyományos oltásokhoz (élő csillapított és inaktivált). A VLP oltás nem képes megismételni a testben, ezért mindenki számára alkalmas, beleértve a terhes nőket vagy a sérült immunrendszerrel rendelkezőket. Ezenkívül a kapszidfehérjék (beleértve más szerkezeti fehérjéket) szegmentált genomokkal, például influenzavírusokkal, afrikai lóbetegség -vírusokkal és bluetongue -vírusokkal is felhasználhatók a VLP vakcinák kidolgozására, anélkül, hogy aggódnának a genetikai rekombinációs problémák miatt, mint például a gyengített élő vakcinák, például. Másodszor, a VLP -k képesek utánozni a valós vírusok szerkezetét, ellentétben az inaktivált oltásokkal, amelyek szerkezeti fehérjéket módosíthatják inaktiválás során, immunogén károsodást eredményezve.
FÜGE. 1. A VLP -k és a kiméra VLP -k képződési mechanizmusa
A VLP oltás jellemzői
1. A természetes vírusokhoz hasonló szerkezet: A VLP-ket egy vagy több szerkezeti fehérjék (például kapszidfehérjék) vírusos összerakása, méretük és alakjuk hasonló a valódi vírusokhoz.
2. Nem fertőző: nem tartalmazza a vírusgenomot, nem képes megismételni vagy betegséget okozni.
3. Magas immunogenitás: A szemcsés szerkezetet az immunrendszer hatékonyan felismerheti, és aktiválhatja a B -sejtek és a T -sejtek válaszát. Indukálhatja a semlegesítő antitesteket és a sejtek immunitását (pl. HIV, HPV oltások).
4. Magas biztonság: alacsony immunfunkciós emberek számára (például hepatitis B VLP oltás).
FÜGE. 2. Rendelkezésre álló VLP oltások
VLP oltási rendszer
A VLP -k különféle expressziós rendszereken keresztül előállíthatók, a közös platformok a következők:
1. Rovarsejt-baculovírus rendszer:
Előnyök: Magas hozam, olcsó, komplex fehérje összeállításhoz.
Alkalmazás: HPV oltás, Ebola oltás.
2. Emlősejtek (pl. HEK293 sejtek):
Előnyök: A poszt-transzlációs módosítások közelebb állnak az emberekhez, és alkalmasak a borított VLP-khez (például influenza-oltásokhoz).
3. Élesztő rendszerek (pl. Pichia Pastoris):
Előnyök: Gyors, olcsó költségeket használnak a hepatitis B oltásban.
4. Növényrendszerek (pl. Dohány kloroplasztok):
Környezetbarát és méretezhető, fejlesztés alatt (pl. Norovírus VLP oltás).
A VLP oltás downstream tisztítási folyamata
A VLP -k expressziós rendszerek sokfélesége a downstream tisztítási folyamatok inniverzitásához vezet.
FÜGE. 3 Egy általános downstream folyamat folyamatábrája
Betakarítás és pontosítás:
Mindenféle tenyésztő táptalajban, a sejttenyészet által támogatva, számos vírusrészecske, valamint számos sejtszövet-törmelék, metabolikus termékek és egyéb szennyeződések léteznek, így a tenyész közepes felhős vagy félig felhő van, ha a tápközeg közvetlenül koncentrálódik, az ultraszűrőmembránot blokkolják, az eredményt nem lehet befejezni, és az ultraáramlás membránja. Ezért először tisztázni kell a koncentráció előtt, hogy eltávolítsuk a nagy részecskéket a tenyésztő tápközegben, hogy áttetsző vagy átlátszó oldatgá váljon, és a tenyésztő tápközeg koncentrációja normálissá teheti a koncentrációs folyamatot, és biztosíthatja az ultraszűrő membrán élettartamát. A tenyésztési oldat koncentrációja előtti tisztázás kulcsfontosságú technikai kapcsolat a koncentráció folyamatában.
A hatékony tisztítási folyamat nagy kapacitás kombinációját igényli a szilárd részecskék, a nagy termék hozama, az egyszerű méretezés és a downstream üzemeltetési egységek védelmének eltávolításához.
Módszer
Centrifugálás: A differenciál centrifugálás eltávolítja a nagy részecskéket.
Mély szűrés: Használjon többlépcsős szűrőt (pl. 1,2 μm → 0.
Tangenciális áramlási szűrés (TFF): Tömegtermeléshez alkalmas, koncentrálja a mintákat és eltávolítja a szennyeződések kis részecskéit.
Ha azonban a tenyésztési skála túl nagy, akkor a centrifugálás hosszú időt vesz igénybe, nagy számú mély szűrőmembránra lesz szükség, így a fogyóeszközök költségei jelentősen megnövekednek. Ugyanakkor a sejttenyészet nagy sűrűsége csökkenti a mély szűrőmembrán terhelését, ami megnövekedett költségeket és túlzott termékhígítást eredményez.
Kétféle TFF membránkomponens létezik: lapos kazetta és üreges rost. A tangenciális áramlási szűrést (TFF) a transzmembrán nyomáskülönbség hajtja. A membrán pórusnál kisebb anyagok és szennyeződések áthaladnak a membránon, míg a szennyeződések, például a nagyobb részecskékkel rendelkező sejtek csapdába esnek. A mikrofiltráláshoz használt membrán pórusmérete {{0}}. 45/0,22 μm. Az üreges rost közvetlenül képes feldolgozni a nagy szilárd tartalmú folyadékot, például a nagy sűrűségű sejttenyésztő táptalajot, kiküszöböli a centrifugálási és a szűrési lépéseket, kevesebb lépést, az egyszerű működést, a membránt többször is felhasználható a berendezések beruházásainak és működési költségeinek csökkentésével, a moduláris automatizált termelés követelményeivel összhangban.
Ultraszűrő koncentráció (TFF):
Cél: A kromatográfiás kezelés mennyiségének csökkentése érdekében javítsák a kromatográfiás hatékonyságot és védjék a kromatográfiás oszlopot.
Általánosságban elmondható, hogy az ultraszűrés (TFF) több mint 100 -szoros VLP -t koncentrálhat, és a heteroprotein eltávolítási sebessége elérheti a 99%-ot. Közülük az üreges szálmembránszűrési technológiának az enyhe és alacsony nyírási erő előnyei vannak, amelyek nem könnyűek, rugalmas működést, hosszú élettartamot, olcsó és egyszerű erősítést, ezért ajánlott az üreges rost kiválasztása a koncentrált és tisztított VLP -hez.
Ha ultraszűrési módszert alkalmaznak a koncentrációhoz és a tisztításhoz, nagyon fontos a megfelelő membrán pórus méretének kiválasztása, amely közvetlenül meghatározza a koncentráció hatékonyságát és minőségét. Egyrészt ki kell választani a membránnyílásot, hogy hatékonyan csapdába ejtse a célmolekulákat a hozam biztosítása érdekében, másrészt a heteroproteinek eltávolítási hatását és feldolgozási sebességét teljes mértékben figyelembe kell venni. Ezért a legjobb elv az, ha kiválasztjuk a membránt a legnagyobb pórusmérettel, amely csapdába ejtheti a célmolekulát, és megpróbálja kiválasztani a szűrőmembránt egyenletes pórusméret -eloszlással.
Elsődleges tisztítás:
1. Csapadék módszer
Polietilén -glikol (PEG) csapadék: A VLP -k szelektív csapadékának optimalizált PEG -koncentrációját és só koncentrációját igényli a hozam és a tisztaság kiegyensúlyozása érdekében.
2. Kromatográfia
Affinitáskromatográfia:
Heparin affinitás: A felületi negatív töltés VLPS tulajdonságainak felhasználása (pl. HPV VLP).
Antitest -kapcsolási kromatográfia: nagy specifitás, de drága.
Ioncserélő kromatográfiát (IEX): Válasszon anioncserét (pl. Q oszlop) vagy kationcserét (pl. SP oszlop), a VLP felületi töltési jellemzőitől függően, és optimalizálja a pH -t és a só gradienst a részecske -aggregáció elkerülése érdekében.
Hidrofób interakciós kromatográfia (HIC): A VLPS felületi hidrofób tulajdonsága alapján, amely néhány nem behatolódott VLP-hez alkalmas.
Finom tisztítás:
Molekuláris kizárási kromatográfia (SEC, gélszűrés):
A maradék gazdafehérjék, nukleinsavak vagy aggregátumok eltávolítása, pufferpótlás kíséretében. Nagy felbontású, de alacsony fluxus, amelyet gyakran használnak a végső finomítási lépésként.
Multi-módú kromatográfia:
Például a Capto Core Series gyanták, az ioncserélő és a molekuláris szitákhatással kombinálva, egy lépésben eltávolíthatják a különféle szennyeződéseket.
Vírus inaktiváció/nukleinsav eltávolítása (szükség esetén):
Nucleáz -kezelések: mint például a benzonáz degrade gazdaszervezet DNS/RNS.
UF/DF: A TFF -rendszer koordinálása a nukleinsavak és enzimek kis fragmenseinek eltávolítására.
Koncentráció és előkészítés:
Tangenciális áramlási szűrés (TFF):
Koncentráljon a cél titerekre, miközben elmozdítja a puffereket (például PBS vagy készítményes puffereket).
Steril szűrés:
0. 22 μm membránszűrés biztosítja a sterilitást.
Tipikus eset
Az alábbiakban bemutatjuk a tipikus VLP oltások downstream tisztítási folyamatait.
Guidlingről
A Guidling Technology egy termelés-orientált és csúcstechnikai vállalkozás, amely a biofarmakonok downstream tisztítására, szétválasztására és tisztítására összpontosít. A termékeket széles körben használják a mAb, oltás, diagnózis, vérkészítmények, szérum, endotoxin és más biológiai termékek szűrési folyamatában; A GUIDLING technológiának "kazetták szűrője és tangenciális áramlási szűrőberendezése", "üreges szálmembrán", "vírusszűrő", "mély membrán", "Sterilizaation szűrő", "centrifugális szűrőeszközök" és más termékekkel rendelkezik, és nagy számú termékvonalat kínál, a kis ártalmatlanítási laboratóriumi szűrésig, a termelési szűrés rendszeréig, a teszteléshez és a termeléshez. A Guidling technológia várja, hogy együttműködjön veled!
