Tanulmány a monoklonális antitestek víruskereső képességéről a downstream folyamatban
A sejtvonalakból származó biotechnológiai termékek ki vannak téve a vírusfertőzés veszélyének – ennek mértéke számos tényezőtől függ, beleértve a készítmény forrását, a felhasznált nyersanyagokat, a gyártási rendszert, a tisztító reagenseket és a segédanyagokat. A vírusok eltávolításának vagy inaktiválásának tanulmányozása a gyártási folyamat során kulcsfontosságú lépés a patogén vírusok iatrogén átvitelének lehetőségének csökkentésében, és ezáltal a kockázat csökkentésében, ami elengedhetetlen a termékek biztonsága szempontjából. Mielőtt a biológiai termékek bekerülhetnének a klinikai vizsgálatokba és forgalomba kerülnének, gyártási folyamatukról bizonyítani kell, hogy képes eltávolítani az ismert és feltételezett vírusokat.
01 Monoklonális antitest termék vírusbiztonsági értékelés
A víruseltávolító képesség kutatása általában az ismert titerindikátor vírus hozzáadásával történik a köztes termékhez a különböző gyártási szakaszokban, majd meghatározzuk a maradék vírustitert egy adott eljárással kezelt mintában, végül értékeljük a log redukciós értéket (LRV). a vírustiter. A 4log10-nél nagyobb vagy egyenlő LRV-re vonatkozó eljárási lépések általában hatékony víruseltávolítási lépések. A folyamat LRV-vel<41og10 can be considered as helpful to increase the total virus clearance in the production process. However, due to the limitations of virus verification, the process with LRV≤11og10 has little significance for virus removal, and its LRV value is not included in the total amount of the production process.
A szimulált gyártási folyamat (redukált folyamat) módszerének alkalmazásakor a tényleges gyártási folyamathoz lehetőség szerint ésszerű víruseltávolítási/inaktiválási kutatási és vizsgálati tervet kell készíteni, különös tekintettel a hatékony gyártási folyamat lépéseire. A szimulált folyamatnak szigorúan összhangban kell lennie a tényleges folyamattal a vizsgálati paraméterek és az ellenőrzési feltételek tekintetében.
02 Általában vírusokat és ellenőrzési sémákat jelöl
A gyakori indikátorvírusokat az 1. táblázat mutatja be.
A vizsgált új gyógyszeralkalmazás (IND) szakaszában egy biotechnológiai termékhez legalább 2 vírusmodell esetében vírus clearance-vizsgálatra van szükség, jellemzően egy retrovírus (X-MuLV) és egy parvovírus (MMV) kiválasztására. A biológiai engedélykérelem (BLA) fázisában a víruseltávolítási vizsgálatokat jellemzően 3-5 specifikus/nem specifikus vírusok felhasználásával végzik, és 3-5 folyamatlépést értékelnek ki annak bizonyítására, hogy a termék megfelelő biztonsági tényezővel rendelkezik. vírusbiztonsági szempont. A különböző hazai és külföldi irányelvek miatt vannak eltérések a nyilatkozatokhoz használt vírusmentesítés ellenőrzési lépései között. Az mAb gyártási folyamatában általánosan használt víruseltávolítási ellenőrzési sémákat a 2. táblázat mutatja be.
03 Víruseltávolító képesség a későbbi folyamatokban
3.1 A downstream folyamatok képessége különböző vírusok eltávolítására
2009-től az FDA-nak benyújtott monoklonális antitesttermékek IND és BLA, Protein A affinitáskromatográfia, alacsony pH, anioncserélő kromatográfia AEX (áramlási penetrációs mód), kationcserélő kromatográfia CEX (kötés - elúciós mód) és víruseltávolítás validálása, kivéve a A vírusszűrés a leggyakrabban használt indikátor víruscsaládok, amelyek kiürülési hatásának átlagát és tartományát az 1. ábra mutatja.
A retrovírusok esetében, a CEX kivételével, amelynek LRV értéke körülbelül 3log10 (ahogy az 1. ábra A-oszlopdiagramja látható), a többi folyamat robusztus volt (LRV nagyobb vagy egyenlő, mint 4log10). A herpeszvírusok és a retrovírusok hasonló kiürülési hatásokkal rendelkeznek, és az LRV > 4log10 (amint azt az 1. ábra B-oszlopdiagramja mutatja). A kis burok nélküli vírusokat, például a parvovírust nehezebb hatékonyan eltávolítani, ellenállnak a vegyszeres kezelésnek, és nem könnyen csapdázzák őket a szűrők (az 1. ábra C-oszlopdiagramja). Csak az AEX és a kis vírusszűrők voltak hatékonyak a parvoviridae eltávolításában (átlagos LRV > 4log10).
Az 1. ábrán látható eljárások a következők: ProteinA, AEX (áramlási penetrációs mód), CEX (együttes-elúciós mód), alacsony pH-jú inaktiválás ("nem teljes" kontra teljes "eltávolítás"), valamint nagy és kis nyílású devírusszűrés.
3.2 A downstream folyamatok víruseltávolítási képességét befolyásoló tényezői
Az egyes folyamatok LRV-értékeinek eloszlását a 2. ábra mutatja. A 0 ~ 21og10-es vizsgálatokat az alacsony LRV-csoportba, a 6log10-nél nagyobb értékeket pedig a magas LRV-csoportba soroltuk összehasonlító elemzés céljából.
3.2.1 ProteinA affinitáskromatográfia
Nem volt szignifikáns korreláció a Protein A eljárás LRV értéke és a kiegyenlítő/mosó puffer, töltőanyag, eluens összetétel és az elúció pH értéke között. Az alacsony LRV csoport közös nevezője, hogy a nyersanyag meglehetősen összetett, és előfordulhat, hogy az alapanyag és a töltőanyag komplex kölcsönhatása negatívan befolyásolja a kromatográfiás oszlop víruseltávolító képességét.
3.2.2 AEX (átfolyási mód)
Strauss et al. kimutatta, hogy az AEX minták pH-ja és vezetőképessége befolyásolhatja az LRV-t. Miesegaes és munkatársai statisztikai eredményei azonban azt mutatták, hogy a ProteinA-hoz hasonlóan az AEX LRV-je (flow penetration mode) nem mutatott szignifikáns korrelációt a különböző pufferekkel, töltőanyagokkal, pH-val és vezetőképességgel, ami a pH és a vezetőképesség optimalizálásának köszönhető. a jelentett esetfolyamat körülményei között.
3.2.3 CEX (kötés – Elúciós mód)
A víruseltávolítás a CEX eljárással nem elég robusztus. Nem volt szignifikáns korreláció a magas LRV csoport LRV és a puffer, a tapasztalati szint vagy a kromatográfiás oszlop tulajdonságai között, mint például az oszlop magassága és a gyanta típusa. Azonban a magas LRV vizsgálatban használt egyensúlyi/terhelési és elúciós pH-értékek egyaránt alacsonyabbak voltak, 5,3±0,2; Az alacsony LRV csoportban a pH 6 volt.0±0.2. Egy másik tényező, hogy a pufferben lévő sókoncentráció is okozhat LRV-érték különbséget. Az alacsony LRV vizsgálatban használt puffer sókoncentrációja magasabb volt, átlagos koncentrációja 290±120 mM volt a töltő/kiegyensúlyozó oldatban és 340±70 mM az eluensben, míg a NaCl koncentrációja a magas LRV vizsgálatban 58 volt. ±27 mM és 183±31 mM.
3.2.4 Alacsony pH-érték inaktiválása
Az alacsony pH-jú eljárásban a pH kulcsfontosságú folyamatparaméter, és a 3,8-as pH elegendő a retrovírus fokozatos inaktiválásához. Az alacsony LRV csoport pH-ja 3,9, míg a magas LRV vizsgálat pH-ja 3,4 volt.
3.2.5 A vírusszűrés eltávolítása
Mind a kis, mind a nagy rekesznyílású szűrők esetében az MuLV eltávolításának LRV értéke nem volt kevesebb, mint 2log10, és csak a vizsgálatok 1%-a volt 3log10 alatt (a 2. ábra h és i oszlopaiban látható). A retrovírusok teljes kiürülése a nagy apertúrájú vírusszűrőkkel alacsonyabb volt, mint a kis nyílású vírusszűrőké (amint az az 1. ábrán látható C-oszlopdiagramon látható). A parvovírus eltávolítás eredményét befolyásoló fő ok a különböző szűrőtípusok. Általánosságban elmondható, hogy a vírusvédelmi szűrés megbízhatóan eltávolítja a vírusokat.
A folyamatok a következők: Protein A(a), AEX behatolási mód (b), CEX kötés - elúciós mód (c), AEX kötés Ⅰ elúciós mód (d), alacsony pH-jú inaktiválás ("nem teljes" és" teljes "kiürülés) (e ~ g), valamint nagy pórusméret (h) és kis pórusméret (i ~ j) devírus szűrés (ahol a ~ i: retrovírus; j: parvovírus).
04 Innovációk és kihívások a vírusbiztonság felmérésében
A downstream biofarmakon folyamatok területén a folyamatos fejlesztés és innováció elkerülhetetlenül újításokat fog eredményezni a vírusmentesítés értékelésében. Az upstream és downstream folyamatok – mint például a folyamatos áramlású biofolyamatok – fejlődése szükségessé tette a hatékony és robusztus víruseltávolítási folyamatok értékelését és létrehozását. A folyamatos áramlás során az olyan lépéseket, mint a vírusinaktiválás és a vírusszűrés, továbbra is kötegelt módban kell végrehajtani. Bár a folyamatos áramlású kromatográfiás eljárások víruseltávolító képessége nem térhet el lényegesen a kötegelt feldolgozásétól, ezt adatokkal kell alátámasztani.
05 Kitekintés
Virológiai biztonsági szempontból a biofarmakon ipar kiváló biztonsága nagyrészt annak tudható be, hogy az iparág szigorúan betartja a vírusbiztonság három kulcsfontosságú stratégiáját: az anyag- és sejtbanki források megfelelő beszerzése és tesztelése, a vírusürítési értékelések dokumentálása (vírus validációs vizsgálatok), és folyamat közbeni vírusteszt. Az új sejtszubsztrátok által termelt biológiai gyógyszerek jellemzői különböző kockázatokkal változhatnak, és jó kockázatkezelési stratégiákra van szükség a biológiai gyógyszerek biztonságosságának biztosításához. A Guidling Technology tapasztalt professzionális műszaki csapattal rendelkezik, amely lefedi a szűrési folyamatot a kispróbától, a kísérleti kísérlettől a nagyszabású gyártásig, membrán- és membránszűrőinket széles körben használják előszűrésben, mikroszűrésben, ultraszűrésben, nanoszűrési koncentrációban, extrakcióban és elválasztásban; Számos termékcsaládunk, a kis egyszer használatos laboratóriumi szűréstől a gyártásorientált szűrőrendszerekig, a sterilitásvizsgálatokig, a fermentációig, a sejttenyésztésig és egyebekig biztosítja a termelékenység növekedését.
Jiuling, hogy biztosítsa a termék minőségét, mint az első mutató, a törekvés a "költségek csökkentése, a hatékonyság növelése" az úton, hogy tárja fel, már alig várom, hogy együtt dolgozhassanak a jövőben, hogy szembenézzenek az ipar kihívásaival és jobb fejlesztésre törekedjenek.
