Tanulmány a hagyományos oszlopkromatográfia membránkromatográfiával való felváltásáról a monoklonális antitestek tisztítására

A hagyományos csomagolt -ágyas kromatográfia kiforrott és megbízható, de korlátozzák olyan korlátok, mint például az alacsony diffúziós hatékonyság, a magas ellennyomás és a lassú feldolgozási sebesség, így egyre nehezebb lépést tartani az upstream folyamatok folyamatosan növekvő termelékenységével. A közelmúltban megjelent egy tanulmányBiotechnológiai fejlődéspotenciális áttörést hozott az iparágban: a kivételesen magas termelékenység és a robusztus tartósság előnyeivel a membránkromatográfia hatékony alternatívájává válhat a csomagolt -ágyas kromatográfiának, és alapvetően átalakítja a downstream mAb-tisztítás környezetét.

Kutatási háttér

 

A tanulmány szisztematikusan értékelte a membránkromatográfiás eszközök különféle típusait, beleértve az ioncserélő és a Protein A affinitású membránokat, és átfogó összehasonlítást végzett a hagyományos csomagolt-ágyas kromatográfiával több dimenzióban, beleértve a kötési kapacitást, a szennyeződések eltávolítását, az élettartamot és az általános tisztítási teljesítményt. Három rekombináns fehérjét választottunk ki a vizsgálathoz, -egy monoklonális antitestet (mAb) és két Fc-fúziós fehérjét-, amelyek lefedik a teljes downstream tisztítási folyamatot a befogástól a polírozásig. A legfontosabb teszteredmények a következők:

 

1. Rögzítési lépés: Protein A membrán kromatográfia - Nagy kötési kapacitás rövid tartózkodási időn

A Protein A kromatográfia az mAb befogásának kritikus lépése. A tanulmány négy Protein A membrán (három kereskedelmi termék és egy prototípus membrán) teljesítményét értékelte két referencia csomagolt{1}}ágygyantával szemben:

• Kiemelkedő dinamikus kötési kapacitás (DBC):Két membrán 50 g/l-t meghaladó DBC-értéket ért el. Egyes membránok 35–65 g/l kötési kapacitást tartottak fenn rendkívül rövid, 0,2 perces tartózkodási idő mellett is, ami összevethető a hagyományos csomagolt -ágyas gyantákkal (37–55 g/L).
• A termelékenység drámai növekedése:A membránkromatográfia tartózkodási ideje mindössze 1/6-1/30-a volt a hagyományos oszlopkromatográfiáénak (0,13-0,33 perc vs. 2-6 perc), ami egyA kötegelt feldolgozás termelékenységének 12-35-szöröse.
• Stabil helyreállítás:A fehérje-visszanyerés meghaladta a 85%-ot az összes membráneszköz esetében. A GORE membrán érte el a legmagasabb, 96%-os visszanyerést, ami lényegében a hagyományos csomagolt -ágyas gyantákhoz hasonlítható (94-98%).
• Figyelembe veendő korlátozások:A membránkromatográfia elúciós térfogatot eredményez1,4-5-ször magasabbmint a hagyományos csomagolt{0}}ágygyanták, míg a HCP clearance valamivel gyengébb volt. Egyes membránok esetében az eluátum HCP-szintje elérte a 7000 ppm-et, szemben a hagyományos töltött -ágyas gyanták 4700 ppm-ével. Ezért,további polírozási lépésekre lehet szükség ennek a korlátozásnak a kompenzálására.

 

2. Polírozási lépés: Ioncsere-Multimodális membránok - Hatékony szennyeződéseltávolítás gyors feldolgozással

A polírozási lépés elsődleges célja a maradék szennyeződések, például a nagy{0}}molekulatömegű- (HMW) aggregátumok és a gazdasejtfehérjék (HCP) eltávolítása. A tanulmány háromféle membránkromatográfiát értékelt: anioncserélő (AEX), kationcserélő (CEX) és multimodális (MM) membránokat.

• Rekord{0}}termelékenység:A membránkromatográfia tartózkodási ideje csak0,17 perc, összehasonlítva2-4 perchagyományos oszlopkromatográfiához, amely a12-24-szeres tartózkodási időés a feldolgozási hatékonyság drámai növekedése.
• A hagyományos oszlopkromatográfiához hasonló szennyeződés-tisztítás:Membránkromatográfia sikerültHMW clearance-tényezők 4,2–5,5, közelít a Capto Adhere gyanta teljesítményéhez (6). AA HCP clearance-tényező elérte a 60-at, egyes membránok felülmúlják a hagyományos csomagoltágyas{0}}kromatográfiát.
• Versenyképes fehérje visszanyerés:A legtöbb membrán elérte90% feletti fehérje visszanyerésés néhány Fc-fúziós fehérje esetében a visszanyerés még magasabb volt, mint a hagyományos oszlopkromatográfiával.

 

3. A folyamat teljes-ellenőrzése: a membránkromatográfia nagy-tisztaságú tisztítást tesz lehetővé

A tanulmány megállapította egyintegrált membrán{0}}alapú tisztítási folyamat, amely a Protein A-befogást a polírozással kombinálja, és közvetlenül összehasonlította a hagyományos csomagolt -ágyas kromatográfiás eljárással:

• Nagy tisztaságú{0}}teljesítmény:A teljes membrán{0}}alapú tisztítási folyamatot követően az Fc-fúziós fehérjékben a HCP szintje csökkent50 ppm alatt, aggregátumokkal (HMW fajok) at0,5% vagy annál kisebb. A monoklonális antitest esetében a HCP-t csökkentették226 ppm, aggregátumokkal at1.0%, közelít a hagyományos töltöttágyas{0}}kromatográfiás eljárás teljesítményéhez (11 ppm HCP és 0,7% aggregátumok).
• Magasabb általános felépülés:Elérte az Fc-fúziós fehérje általános visszanyerését89%, ami volt19%-kal magasabbmint a hagyományos töltöttágyas{0}}kromatográfiás eljárásé. A monoklonális antitest esetében a visszanyerés a következő volt73%, ami a hagyományos csomagolt{0}}ágyas eljáráshoz hasonlítható.
• Erős szennyeződési ellenállás:A membránkromatográfia jobb toleranciát mutatott a nagy szennyezőanyag-terhelésű alapanyagokkal szemben, és akkor is hatékony maradt, haa kezdeti HCP-koncentráció elérte a 150 000 ppm-et.

 

4. Élettartam: stabil működés 100+ ciklusokhoz, megfelel a gyártási követelményeknek

A membrán tartóssága kritikus tényező az ipari alkalmazásokban. A vizsgálat a membránstabilitást ezen keresztül értékelte201 egymást követő működési ciklus:

• Meghosszabbított ciklus élettartam:A nyolc membránból hét elkészülttöbb mint 100 ciklus, míg a prototípus multimodális (MM) membrán elérte201 ciklusjelentős teljesítményromlás nélkül.
• Stabil teljesítmény:A kerékpáros tanulmányozás sorána fehérje visszanyerése 90% körül maradt, a HMW vagy HCP eltávolítási teljesítmény jelentős csökkenése nélkül. A nyomásprofilok is stabilak maradtak.
• Alkalmas gyártási alkalmazásokhoz:A legtöbb membrán képes volt megtámasztanilegalább egy teljes gyártási ciklus, míg egyesek több köteget is támogathatnak. A felgyülemlett nyomásnövekedés mérsékelhető atiszta-helyben-(CIP) stratégia.

 

Technikai kiemelések: Miért helyettesítheti a membránkromatográfia a hagyományos oszlopkromatográfiát?

A membránkromatográfia fő előnyei az egyedülálló lapos{0}}membránszerkezetből fakadnak. A hagyományos porózus kromatográfiás gyantákkal összehasonlítva a membránkromatográfia három fő különbséget kínál:

1. Innovatív tömegátviteli mechanizmus:A membránok elsősorban konvektív tömegtranszferen alapulnak, így nincs szükség a fehérjéknek porózus közegekbe való diffundálására. Ez jelentősen csökkenti a tartózkodási időt és sokkal gyorsabb feldolgozást tesz lehetővé.
2. Jelentősen alacsonyabb ellennyomás:A lapos -lemezszerkezet alacsony áramlási ellenállást biztosít, és nagyobb áramlási sebességet is képes kezelni, felülmúlva a hagyományos oszlopkromatográfiával általában összefüggő ellennyomás-korlátozásokat.
3. Erős folyamat alkalmazkodóképesség:A membránkromatográfia kompatibilis a folyamatos gyártással, és jobban megfelel az upstream folyamatok magas termelékenységének. Ezen túlmenően a kisebb berendezési terület és az alacsonyabb membránhordozó-igény hozzájárulhat az általános gyártási költségek csökkentéséhez.

Természetesen a membránkromatográfiának is vannak bizonyos korlátai. Ezek közé tartoziknagyobb elúciós térfogatok, amelyek további pufferfogyasztást igényelnek; a szennyeződések eltávolításának további javításának szükségessége az olyan kihívást jelentő minták esetében, mint plbispecifikus antitestek (bsAbs); és egyes membrántermékek korlátozott elérhetősége a nagy gyártási méretekben. Ezek a kihívások azonban fokozatosan kezelhetők az optimalizált berendezéstervezés, a további mélységi{1}}szűrési lépések beépítésével és egyéb folyamatfejlesztésekkel.

Iparági hatás: A monoklonális antitest-gyártás a nagy hatékonyságú tisztítás korszakába lép{0}}

A tanulmány eredményei egyértelmű irányt adnak a biogyógyszeripar számára a technológiai fejlődéshez. A hagyományos mAb és Fc-fúziós fehérje tisztítási eljárásokhoz, amelyek a nagy termelékenységet részesítik előnyben,a membránkromatográfia teljes mértékben felválthatja a hagyományos töltött{0}}ágyas oszlopkromatográfiát. A membránkromatográfiát és a hagyományos kromatográfiás gyantákat alkalmazó kombinációs stratégia még összetettebb alapanyagok esetén is segíthet optimális egyensúlyt elérni a feldolgozási hatékonyság és a termék tisztasága között.

Ahogy a membránanyag-technológiák tovább fejlődnek, a jövőbeni fejlesztések várhatóan tovább csökkentik a pufferfogyasztást és javítják a méretezhetőséget, felgyorsítva a biogyógyszeripart.folyamatos, nagy{0}}hatékonyságú és költséghatékony{1}}gyártás.

A biogyógyszergyártók számáraa membránkromatográfia korai alkalmazása és stratégiai alkalmazása fontos versenyelőnnyé válhat a fejlődő piacon.