Milyen hatással van a takarmánykoncentráció az ultrafiltrációs kazettákra?

Amikor szűrőszállítóként először elkezdtem ultraszűrő (UF) kazettákkal dolgozni, bevallom, nem sokat gondolkodtam a takarmánykoncentráción azon túl, hogy ellenőriztem, hogy az általam feldolgozott oldat „elég vastag-e”. Ez gyorsan megváltozott – amikor egy biotechnológiai kliens falba ütközött az antitestkoncentrációs lépésével, és a gyakori eltömődést és a furcsán inkonzisztens fluxus sebességet okolta. Kiderült, hogy sokkal többet nyomtak, mint amennyit az UF-kazettájuk elbír, és ez több napos állásidőbe és egy tétel drága termékbe került nekik. Ha UF-kazettákkal dolgozik, ez nem csak egy apró részlet – ez az egyik legnagyobb eszköz, amely elősegíti vagy megszakítja a folyamatot, a hozamtól a futási időig. Soroljuk fel, hogyan befolyásolja a takarmánykoncentráció az UF minden részét, és mit tanultam az évek során, hogy a dolgok gördülékenyen menjenek.

Először is alapozzuk meg ezt abban, amit az UF kazetták valójában csinálnak, csak hogy megbizonyosodjunk arról, hogy ugyanazon az oldalon vagyunk. Ha még nem ismeri a játékot, az UF kazetta egy önálló egység, lapos membránokkal (nézze megLapos kazettaoldal a teljes lebontáshoz), amely méret szerint választja el a molekulákat – a kis dolgok áthaladnak a membránon, míg a nagyobbak „megmaradnak” és a betáplálási oldalon koncentrálódnak. Mitől olyan népszerűek a biofarmában, az élelmiszerekben és italokban, valamint a szennyvízben? Kompaktak, újrafelhasználhatók (néha, ha megfelelően tisztítják), és sokkal konzisztensebbek, mint a régebbi, kézzel vágott membránszerkezetek. AUltrafiltrációs kazettákAz általunk kínált terméksor méretezhető sorozatokhoz készült, a kis laboratóriumi tételektől a teljes gyártásig, ezért dolgoztunk együtt az ügyfelekkel a startup biotechnológiáktól a globális élelmiszermárkákig.

A takarmánykoncentráció azok számára, akik nem merültek bele a terminológiába, alapvetően a cél (vagy nem kívánt) oldott anyag mennyisége az oldatban, amelyet a kazettába pumpál. Például, ha monoklonális antitesteket (mAb-ket) koncentrál egy sejttenyésztő táptalajból, a takarmánykoncentráció itt azt jelenti, hogy hány gramm monoklonális antitestet tartalmaz az adott táptalaj literenként. Ez nem csak a célpont – olyan szennyeződések is vannak benne, mint a sejttörmelék, a médiakomponensek és a maradék puffersók. A takarmánykoncentráció édes pontja a membrán molekulatömegének határértékétől (MWCO) függően eltérő, igaz? A 30 kD-s UF-kazetta kiválóan használható kis fehérjékhez, míg az 500 kD-os nagyobb molekulákhoz, például vírusvektorokhoz. Láttam, hogy a kliensek megragadják az első kazettát, amit megnéznek, függetlenül a takarmánykoncentrációjuktól, és itt kezdődnek a hibák.

Kezdjük a legközvetlenebb hatással: a fluxus rátával. A fluxus az az oldat térfogata, amely egységnyi területen óránként áthalad a membránon – ez az UF termelékenységének gerince. Ha a takarmánykoncentráció túl magas, a fluxus gyorsan csökken, és nem lineárisan. Ennek oka: az oldat feldolgozása során a visszatartott oldott anyagok felhalmozódnak a membrán felülete közelében, és úgynevezett „koncentrációs polarizációs réteget” alkotnak. Ez a réteg extra gátként működik, így a víznek és a kis oldott anyagoknak keményebben kell dolgozniuk, hogy átjussanak. Ha a betáplálási koncentráció kezdetben extra magas, akkor a polarizációs réteg gyorsan megvastagodik, és hamarosan alig nyomunk át rajta. Tavaly volt egy ügyfelem, aki egy 30 kD-s ultraszűrő kazettát használt sűrű sejttenyészet felülúszón – 25 g/l fehérjét etettek, amikor az ajánlásunk 10–15 g/l volt. Fluxusuk 60 l/m²/óráról 12 l/m²/órára csökkent 2 óra alatt, és le kellett állniuk, hogy idő előtt megtisztítsák a kazettát, ami 12 óra üzemidőt veszített el. Még ennél is rosszabb, hogy a nagy koncentrációjú polarizáció miatt egyes fehérjék megragadtak ebben a rétegben, így hozamuk 18%-kal alacsonyabb volt a vártnál.

De ez nem csak a fluxus – a takarmánykoncentráció közvetlenül kapcsolódik a membránok elszennyeződéséhez is, ami az UF nagy buzgója. A szennyeződés az, amikor az oldott anyagok, törmelékek vagy aggregátumok tartósan megtapadnak a membrán felületén vagy a pórusok falán, és ez még rosszabb a túlzottan koncentrált takarmányok esetén. Ha az oldott anyagokat összezsúfolják a takarmányban, nagyobb valószínűséggel ütköznek a membránnal, és csapdába esnek. Több száz UF-kazettát tisztítottam meg az évek során, és az esetek 80%-ában az erős szennyeződés nyomai az ajánlott tartomány 2-3-szorosára visszavezethető tápkoncentrációra vezethetők vissza. Például egy gyümölcslevet feldolgozó élelmiszer-ügyfél egy menetben 30° Brix-re akart koncentrálni a 15° Brix helyett (ami a 10 kD-s kazettájának édes pontja). A lé pektinje és cukorja 30 percen belül elkezdett felhalmozódni a membránon, és a futtatás végére a membrán pórusai részben eltömődtek, így csak a várt koncentráció negyedét kapták meg, és 10 helyett három futtatás után kellett a kazettát kicserélni. Ez jóval magasabb literenkénti költséget eredményezett, mintha minden alkalommal két menetre osztanák fel a koncentrációt alacsonyabb tápkoncentráció mellett.

A hozam egy másik olyan terület, ahol a takarmánykoncentráció súlyosan érinti, különösen a biofarmában, ahol a termék minden grammja számít. Ha a takarmány túl tömény, akkor nemcsak több szennyeződést kap, hanem kétféleképpen is látni fogja a termékvesztést. Először is, a koncentrációs polarizációs réteg meg tudja fogni a célmolekulákat, és ha túl vastag lesz, akkor ezek a molekulák a koncentrálás helyett a retentátummal együtt elszállhatnak a kazetta leürítésekor. Másodszor, egyes célmolekulák (például a fehérjék) nagy koncentrációban aggregálódni kezdhetnek, és ezek az aggregátumok gyakran elég kicsik ahhoz, hogy átcsúszjanak a membránon, vagy megakadjanak a permeátumban, így elveszítik őket. Egy vírusvektor-kliens, akivel tavaly dolgoztam, az 500 kD-s Ultrafiltration Cassette-nket használta az AAV-vektorok koncentrálására – a betáplálási koncentrációt 1e13 vektorgenom/ml-re növelték, ami jóval meghaladja a 2e12-es ajánlásunkat. Termésük csak 45% volt, szemben azzal a 82%-kal, amit akkor kaptak, amikor a takarmánykoncentrációt a megfelelő tartományba csökkentették. A retentátum tesztelésekor azt találtuk, hogy a célvektoruk 30%-a megragadt a koncentráció-polarizációs rétegben, további 15%-a pedig aggregálódott és elveszett. Ez az a fajta ütés, amely értéktelenné tehet egy egész tételt, különösen, ha GMP-kompatibilis folyamatokkal van dolgunk, ahol nem lehet csak úgy, hogy több terméket készítsünk.

Várjon, de mielőtt azt gondolná, hogy „az alacsonyabb takarmánykoncentráció mindig jobb” – ez sem igaz. Ha a takarmány túl híg, időt és kazettakapacitást pazarol. Az UF akkor a leghatékonyabb, ha az oldatot ésszerű szintre koncentrálja, de ha túl vékony táppal kezdi, akkor a kelleténél jóval nagyobb mennyiséget mozgat, ami növeli a szivattyúzás energiaköltségét, és tovább tart a célkoncentráció elérése. Például egy kis fehérjemintát koncentráló laboratóriumi kliens egy 10 kD-s kazettát használt 0,1 mg/ml tápkoncentrációval – 10 mg/ml-re próbáltak elérni, így 100 ml oldatot dolgoztak fel, hogy 10 ml retentátumot kapjanak. 8 órába telt, szemben a 2 órával, amikor először centrifugálással koncentrálták a takarmányt 0,5 mg/ml-re, így csak 20 ml-t dolgoztak fel. Ez óriási különbség a munka és az idő tekintetében, különösen, ha naponta több tételt futtat. A kulcs a középső tartomány elérése – amit én „koncentrációs ablaknak” nevezek az adott kazettához és alkalmazáshoz.

Szóval hogyan lehet kitalálni ezt a koncentrációs ablakot? Ez nem egy mindenki számára megfelelő, de van néhány ökölszabály, amelyet minden ügyfelünkkel megosztunk. Először is ellenőrizze a kazetta MWCO-ját: a magasabb MWCO-val (például 500 KD) rendelkező kazetta általában nagyobb betáplálási koncentrációt tud kezelni, mint egy alacsonyabb MWCO (például 30 KD), mivel a pórusok nagyobbak, így a polarizáció kevésbé probléma. A miénkKazettás-TFF-szűrő sorozatoldalon minden kazettához meghatározott koncentráció-tartományok vannak, de általános szabály, hogy a legtöbb fehérjealkalmazásnál soha ne haladja meg a 10–15%-ot, kis molekuláknál pedig az 5–10%-ot. Másodszor, ellenőrizze a takarmány szennyeződéseit: ha a takarmányban sok törmelék vagy aggregátum van, akkor alacsonyabb takarmánykoncentrációra van szüksége, hogy elkerülje a szennyeződést, függetlenül attól, hogy mi a célmolekula. Harmadszor, először futtasson kis léptékű teszteket – ne csak a teljes termelésbe ugorjon. Egy 100 ml-es vagy 1 literes próbaüzem pontosan megmondja, hogy milyen fluxust kap, milyen gyorsan szennyeződik be, és milyen hozamra számíthat, így nem veszíti el az értékes terméket.

Egy másik dolog, amit észrevettem az évek során, hogy a betáplálás koncentrációja kölcsönhatásba lép más folyamatparaméterekkel, például a keresztáramlási sebességgel és a transzmembrán nyomással (TMP). Ez nem olyan, mint a koncentráció beállítása vákuumban – ha magas a betáplálási koncentráció, akkor egy kicsit kompenzálhatja a keresztáramlási sebesség növelésével, ami elsöpri a polarizációs réteget a membrán felületétől, és növeli a TMP-t (de nem túlságosan, mert a TMP a polarizációs réteg tömörödését okozhatja). De ez kiegyensúlyozó: a nagyobb keresztáramlás több energiát jelent, a magasabb TMP pedig membránkárosodáshoz vezethet, ha nem vigyázol. Mindig azt tanácsoljuk ügyfeleinknek, hogy végezzenek teljes paraméter-tesztet, amely magában foglalja a takarmánykoncentrációt is, mert az egyik megváltoztatása kidobhatja a többit. Például egy ügyfél egyszer megpróbálta kijavítani a nagy takarmánykoncentrációból származó fluxusesést a TMP felhajtásával, és végül összetömörítette a membránt, így a következő futtatásoknál még alacsonyabb volt a fluxus. Cégünknél ezért nem csak kazettákat árulunk, hanem segítünk ügyfeleinknek ezeken a folyamatzavarokon, mert szinte minden hibát láttunk, amit a takarmánykoncentrációval elkövethet.

Beszéljünk a hosszú távú hatásokról is, mert a takarmánykoncentráció nem csak egyetlen futtatásra van hatással, hanem a kazetta élettartamára is. Ha túlzottan koncentrált takarmányt használ, sokkal több szennyeződést hoz létre, ami azt jelenti, hogy gyakrabban kell tisztítania a kazettát, és agresszívebb tisztítószereket (például magasabb pH-t vagy hőmérsékletet) kell használnia, hogy megszabaduljon a lerakódásoktól. Idővel ez az agresszív tisztítás lerontja a membránt, így a kazetta kevesebbet fut, mielőtt ki kell cserélni. Volt olyan kliensem, amelyik a lapos lapkazettánkat futtatta, és az 5. futtatásra ki kellett cserélni erős szennyeződés miatt, míg egy másik, ugyanazt a kazettát megfelelő adagolási koncentráció mellett futtató kliens 15+ futtatást kapott. Ez óriási költségkülönbség, ha hetente nézegeti a kazettákat minden hónapban.

Most pedig lássuk a gyakorlatot – mit kell tennie, ha a takarmánykoncentráció nem megfelelő? Először is mérje meg megfelelően. Sok ügyfél a megoldás „vizuális vastagsága” alapján megy végbe, ami rendkívül pontatlan. Használjon Brix-mérőt élelmiszerekhez, vagy abszorbanciamérőt (például A280-at fehérjékhez) a pontos koncentráció eléréséhez. Ezután állítsa be a takarmányt úgy, hogy hígítja (ha túl magas), vagy tovább koncentrálja egy kisebb előfeldolgozási lépéssel (például tangenciális áramlási szűréssel egy másik kazettával vagy centrifugálással), ha túl alacsony. Ha egyedi takarmányozással foglalkozik, például egy egyedi biológiai gyógyszerrel, forduljon csapatunkhoz – alkalmazásszakértőink segítenek Önnek a takarmánykoncentrációjához szabott folyamat megtervezésében, legyen szó a megfelelő MWCO kiválasztásáról (például 30 KD vagy 500 KD), a keresztáramlás beállításáról vagy a legjobb futási idő meghatározásáról.

Nem tudom eléggé hangsúlyozni, hogy a takarmánykoncentráció apró módosításai mennyire megváltoztathatják az egész UF-folyamatot. Ez nem egy unalmas részlet – ez a különbség egy olyan futás között, amely eléri az összes hozam- és idővonal-célt, és egy olyan futás között, amely napokig a hibaelhárítást hagyja maga után, termék- és pénzpazarlással. Felépítettük a magunkétUltrafiltrációs kazettákrugalmas legyen, különféle MWCO-k számára (mint például a miénk).30 kd ultraszűrő kazettákés500KD ultraszűrő kazetták), síklapos kialakítások és TFF sorozat beállításai, mert tudjuk, hogy minden ügyfél hírfolyama más. Ha takarmánykoncentráció-problémákkal küzd, vagy csak hatékonyabbá szeretné tenni az UF-folyamatot, itt vagyunk, hogy segítsünk – ügyfeleink ezreivel dolgoztunk együtt, hogy megfelelő koncentrációs ablakokat alakítsunk ki, és ugyanezt megtehetjük Önért. Ne hagyja, hogy egy olyan apró részlet, mint például a takarmánykoncentráció tönkretegye a futásokat – forduljon csapatunkhoz, hogy még ma többet megtudjon a folyamat optimalizálásáról.

Hivatkozások

1. Belfort, G., Davis, RH és Zydney, AL (1994). Szuszpenziók és makromolekuláris oldatok viselkedése keresztáramú mikroszűrésben. Journal of Membrane Science, 96(1–2), 1–58.
2. Charcosset, C. (2007). Hidrodinamikai és koncentrációs polarizáció az ultraszűrésben: áttekintés. Sótalanítás, 211(1–3), 108–122.
3. Zydney, AL (2018). Tangenciális áramlású szűrés biogyógyszerészeti feldolgozáshoz. Current Opinion in Chemical Engineering, 20, 109–115.
4. Mulder, M. (1996). A membrántechnológia alapelvei (2. kiadás). Kluwer Academic Publishers.