Membrántechnológia és vakcinatisztítás (Ⅰ)
A vakcinák számos forrásból származnak, beleértve a szövetkivonatokat, baktériumsejteket, vírusrészecskéket, fehérjéket és emlős rekombináns sejtek, élesztő- és rovarsejtek által termelt nukleinsavakat.
A vakcina előállításának legáltalánosabb módja egy kezdeti fermentációs folyamaton alapul, amelyet tisztítás követ. A vakcina előállítása egy összetett folyamat, amely sok különböző lépésből és folyamatból áll. A megfelelő tisztítási módszer kiválasztása kritikus fontosságú a végtermék kívánt tisztaságának eléréséhez. A vakcinák tisztázása fontos lépés, amely jelentős hatással van a termék visszanyerésére és az azt követő későbbi tisztításra. A vakcinák tisztázására többféle technika alkalmazható. A begyűjtési mód és berendezés kiválasztása az akkumulátor típusától, a gyűjtendő termék jellegétől és a folyamatfolyadéktól függ. Ezek a technikák közé tartozik a membránszűrés (mikroszűrés, tangenciális áramlási szűrés), a centrifugálás és a mélyszűrés (normál áramlású szűrés). Hosszú tapasztalatok alapján az oltóanyag-gyűjtést általában centrifugálással, majd mélyszűréssel érik el.
Az elmúlt években a membránalapú technikák előtérbe kerültek a vakcina tisztázásában. Az upstream folyamatok egyre gyakrabban használnak eldobható technológiákat, ezért a betakarítási stratégiákat meg kell változtatni. Ez a cikk átfogó áttekintést nyújt a különböző membránalapú technológiákról és azok alkalmazásáról a vakcina tisztázásában.
01 Bevezetés
A vakcinák a fertőző betegségek megelőzésének kritikus elemei, amelyek továbbra is sokkoló halálokot okoznak. Évente 2-3 millió embert mentenek meg a diftériától, a tetanusztól, a szamárköhögéstől és a kanyarótól az immunizálásnak köszönhetően. A vakcinák széles skáláját fedik le, a kis rekombináns fehérjéktől a teljes vírusrészecskékig és teljes baktériumokig. Különböző rendszerek állíthatják elő őket: tojás, emlőssejtek, baktériumok stb. A vakcinák összetettsége és sokfélesége miatt jelenleg nincs általános tisztítási protokoll vagy sablon, annak ellenére, hogy az oltóanyag-platformok iránt egyre nagyobb az érdeklődés.
Az oltási folyamat jellemzően három részre osztható: felfelé (előállítás és derítés), utáni kezelésre (tisztítás, beleértve az ultraszűrést, kromatográfiát és kémiai kezelést) és formulázásra (végső töltési műveletek). A gyártási rendszertől függetlenül a derítés (a nem kívánt anyagok kezdeti eltávolítása) kulcsszerepet játszik a robusztus tisztítási folyamat meghatározásában. A megfelelő derítési lépés főként egész sejteket, sejttörmeléket, kolloidokat és nagy aggregátumokat távolít el, hogy csökkentse a későbbi feldolgozás terheit. Egyes esetekben a derítés csökkentheti az oldhatatlan szennyeződéseket, a gazdasejtfehérjéket (HCP) és a gazdasejt nukleinsavait is. Mint minden más tisztítási lépést, a derítési lépést is optimalizálni kell a maximális termékhozam és tisztaság elérése érdekében, miközben alkalmazkodik a vakcina specifitásához és gyártási korlátaihoz.
A vakcinatípusok heterogenitása miatt a derítéshez számos technikát alkalmaznak, beleértve a centrifugálást vagy a szűrést (1. táblázat).
A kívánt tisztázás eléréséhez általában több műveletsorra van szükség. Az első művelet a nagyobb részecskék eltávolítására szolgál (elsődleges derítés), a második művelet pedig a kolloidok és más mikron alatti részecskék eltávolítására szolgál (másodlagos derítés). A kis sebességű centrifugálás egyszeri derítési lehetőségként szolgál, lehetővé téve a sejtek és sejttörmelékek kicsapással történő eltávolítását. A centrifugálás nagy szilárd terhelést is képes kezelni, és széles körben alkalmazzák szakaszos vagy folyamatos üzemmódban és tárcsás centrifugákban. Magas tőkebefektetési és karbantartási költségeket igényel, és kihívásokkal kell szembenéznie a méretnövelés során, mivel nincs megbízható skálázási modell. Egyes kereskedelmi vakcinagyártók azonban centrifugákat használnak nagyüzemi termelésben, amely nagy feldolgozási mennyiségeket és több gyártási tevékenységet foglal magában.
A derítő szűrés elvégezhető normál áramlású szűréssel (NFF, más néven zsákutcás szűrés) vagy tangenciális áramlási szűréssel (TFF, más néven keresztáramú szűrés). Léteznek speciális szűrőmódok (mélyszűrők), amelyek pozitív töltésű anyagokat és szűrő AIDS-t tartalmaznak, amelyek fokozzák a sejttörmelékek, kolloidok és negatív töltésű nemkívánatos komponensek visszatartását.
A membránszűrők méretkizárással tartják vissza a részecskéket, és nem rendelkeznek nagy szennyeződésmegtartó képességgel, ezért alkalmasak másodlagos derítési lépésekre. Mind a mélyszűrők, mind a membránszűrők könnyen méretezhetők és kivitelezhetők (egyszerű rendszertervezés). Az NFF-től eltérően a TFF-et elsősorban elsődleges derítésre (mikroszűrésre) használják. A 0.1-0.65 μm-es (lehetőleg nyitott csatornával rendelkező) membránokat sikeresen alkalmazták a sejtek, sejttörmelékek és más nagy szennyeződések megtartására. A legtöbb TFF berendezés lineárisan méretezhető és tisztítás után újrafelhasználható, ami jelentősen csökkenti a lépéshez szükséges fogyóeszközök költségét.
A tisztázási lépés az upstream és a downstream folyamatok között található, és néha figyelmen kívül hagyják a vakcina-eljárás fejlesztése során, mivel az idő és az erőforrások prioritást élveznek más tisztítási lépéseknél, mint például a kromatográfia vagy a sűrűséggradiens centrifugálás.
Még a vakcinagyártási eljárásokra vonatkozó szabadalmak is gyakran kihagyják a tisztázási lépést. A tisztítási hatékonyság közvetlenül befolyásolja a downstream folyamat teljesítményét. A rosszul optimalizált derítési lépés negatívan befolyásolhatja a sterilizált szűrő kapacitását, vagy lerövidítheti a kromatográfiás gyanta élettartamát. Manapság a szigorúbb szabályozási elvárások miatt a vakcinagyártók tisztább, jól jellemezhető, de megfizethető oltóanyagokat állítanak elő. Ebben az esetben minden lépésre a megérdemelt figyelmet kell fordítani. A jelenlegi tendenciák arra utalnak, hogy az upstream folyamat egy "tisztább" expressziós rendszer felé halad (azaz a szérummentes tápközegben tenyésztett sejtek helyettesítik a petéket), megnövekedett termelékenységgel és magasabb sejtsűrűséggel.
A végtermék tisztaságának növelése érdekében a későbbi tisztítási folyamatokat egyszerűsítik és áramvonalasítják. E változások kezeléséhez a tisztázási lépés nem válhat szűk keresztmetszetté. Ebben az esetben a szűrési technológia egy új tisztázási kihívásnak felel meg, amely a megnövekedett folyamatrugalmasság, az egyszeri felhasználás lehetősége és a beruházási költségek csökkentése kérdéseivel foglalkozik.
02 A vírusvakcinák tisztázása
Többféle tisztázási módszert, akár önmagában, akár kombinációban, sikeresen alkalmaztak a vakcinák takarmányozási végén a betakarítás tisztázására.
Kísérleti méret:1-20L, gyártási méret: több mint 20 liter
2.1 Óvintézkedések a vírusvakcinák tisztázásához
Sok vakcina a vírusrészecskék egészét vagy egy részét tartalmazza, hogy immunitást hozzon létre a vírusfertőzéssel szemben. Általában négy nagy kategóriába sorolhatók:
Élő attenuált vakcina (LAV), amely a vírus legyengített törzsén alapul, hogy csökkentse annak virulenciáját. A legyengített vírusok szaporodhatnak a szervezetben, de nem patogének.
- Inaktivált vírus (IV) vakcinák, amelyek kémiailag vagy ultraibolya sugárzással inaktivált vírusokat tartalmaznak a fertőzőképesség megszüntetése érdekében. A vírusrészecskék lehetnek teljesek, osztottak vagy tisztítottak (csak antigén fehérjék).
- A vírusvektor (VV) vakcina egy aktív, nem patogén vírus, amely egy patogén vírus antigénjét mutatja be. Ezeket a nemrég kifejlesztett struktúrákat génterápiás alkalmazásokhoz is használják.
Vírusszerű részecskék (VLP-k) vakcinák, a vírusalegység vakcinák egy specifikus osztálya, amelyek utánozzák a vírusrészecskék általános szerkezetét, de nem tartalmaznak fertőző genetikai anyagot.
A legtöbb esetben a vírusrészecskék teljesen épek a derítési lépés során, még a vírusvakcina lízise során is (a hasítást általában lefelé, tisztább környezetben végzik).
A vírustisztítás fő kihívása a nagy hozamú vírusrészecskék visszanyerése, miközben hatékonyan eltávolítja a sejttörmeléket, a nagy aggregátumokat és az oldhatatlan szennyeződéseket. A következő szakaszokban leírtak szerint számos tényező okozhatja a vírus lebomlását vagy elvesztését. Ezen túlmenően, a vírushozamra nehéz lehet támaszkodni, mivel a vírus kvantitatív vizsgálati módszerei igen változatosak a folyamat ezen szakaszában, különösen a LAV és VV vakcinák esetében. Ezeknél a vakcináknál a vírushozamot gyakran fertőzőképességi tesztekkel, például plakk teszttel vagy TCID 50 teszttel értékelik. Az a tény, hogy a begyűjtött vegyületek némelyike megzavarhatja a vírus azon képességét, hogy megfertőzze a jelzősejteket, növeli ennek a kvantitatív megközelítésnek a változékonyságát.
2.2 A vírusvakcina tisztázási stratégiája
A vírusoltások mérete, szerkezete, alakja és expressziós rendszere nagymértékben különbözik (3. táblázat).
Ennek eredményeként általában nincs sablon a későbbi folyamatokhoz, különösen a tisztázási lépésekhez. Elméletileg minden rendelkezésre álló technika (kis sebességű centrifugálás, mikroszűrés TFF, NFF) kiválasztható és potenciálisan kombinálható a vírus tisztázására. Valójában a derítési módszerek sikerét az expressziós rendszer és az érintett vírusok fizikai-kémiai tulajdonságai befolyásolják.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} sejt/ml) kationos polimereket alkalmazó derítési módszerrel a mélyszűrési terület négyszeresére csökkent a hagyományos módszerekhez képest. Ez a technika lehetővé teszi nagy kapacitású fermentorok betakarítását centrifugák használata nélkül. Hasonlóképpen Riske et al. kimutatták, hogy az 1.4-2,6% szilárd anyagot tartalmazó 40 literes sejtkultúrák (0,02%) kitozánkezelése 7-szeresére növelte az abszolút szűrőkapacitást mélyszűrés után.
Azt is megemlítik, hogy a kitozán a jelek szerint javítja a derítés hatékonyságát azáltal, hogy flokkulálja a szubmikronos részecskéket, amelyek jellemzően centrifugákban ülepednek. Az előkezelési és flokkulációs módszerek valószínűleg továbbra is részét képezik a vakcinák szűrésével kapcsolatos jövőbeli tisztázásoknak. A behatoló anyagok, beleértve a cukrokat, glikolokat és aminosavakat, elsősorban flokkulálják a vírusokat. Az ozmotikus oldattal végzett vírusflokkuláció, majd a 0.2µ mikroszűrés átfogó vírustisztítási eljárásként használható. A penetránsok serkenthetik a vírus aggregációját azáltal, hogy csökkentik a részecskék körüli hidratációs réteget, így flokkulálják a hidrofób, nem kapszulázott vírusrészecskéket és a kapszulázott vírusrészecskéket. Noha a penetránsokról kimutatták, hogy flokkulálják a vírusokat, a módszer potenciálisan platformot jelenthet a jövőbeni vakcinatisztításhoz, és megvalósíthatósága kísérleti vagy nagyszabású vakcinatisztításban nem bizonyított. A flokkulációs előkezelési módszert, amely valószínűleg továbbra is része lesz a jövőbeni vakcinaszűrő-tisztításnak, 2 literes fermentorban hajtják végre. Ahhoz, hogy potenciálisan nagyüzemi termelési műveletekben lehessen őket használni, ezeket a módszereket kísérleti és gyártási léptékben validálni kell.
2.2.1 A rendszer hatásának kifejezése
A derítési módszer elsősorban az upstream folyamat és az expressziós rendszer típusától függ, amely meghatározza az eltávolítandó szennyeződések típusát és szintjét. A vírusvakcinákat általában csirkeembriókban állítják elő emlősök vagy madarak folyamatos sejtvonalai vagy bakulovírus/rovarsejtek, amelyek összetettebb expressziós rendszert jelentenek. A VLP-k bizonyos típusait más heterológ expressziós rendszerek (baktériumok, élesztőgombák, növényi sejtek) is előállíthatják.
2.2.1.1 Csirkeembrióban termelődő vírus
A vakcinákat évtizedek óta tojásban állítják elő. Ez a munka 1931-ig nyúlik vissza, amikor Woodruff és Good Pasture sikeresen alkalmazta a termékeny peték chorio-allantois membránját a vírusszaporodás szubsztrátumaként. Ma is számos humán és állatgyógyászati vakcinát állítanak elő ezzel az ősi eljárással. A legismertebb talán a szezonális influenza elleni védőoltás. Az alapelv az, hogy a csirketojásokat beoltják az érdeklődésre számot tartó vírusokkal, majd a chorio-allantois membránban szaporodnak. A szaporodás után a vírusrészecskékben gazdag allantois folyadékot összegyűjtik és megtisztítják.
Az allantois folyadék kihívást jelentő tisztító táp. Magas ásványianyag- és fehérjetartalma (beleértve az ovalbumint is) magas viszkozitást biztosít. Az allantois folyadék a csirkeembriókból származó esszenciális szöveti vegyületeket is tartalmaz, mint például a toll, a csőr, az erek vagy a vérsejtek. A magas szilárdanyag-tartalom miatt a kis sebességű centrifugálás a preferált lehetőség az elsődleges derítéshez, amely jellemzően körülbelül 70%-os visszanyerési arányt eredményez. Azonban lehetséges az elsődleges derítés is szűrési technikákkal. Az NFF esetében a polipropilén és cellulóz alapú mélyszűrők jó allantois folyadékgyűjtő képességgel rendelkeznek. A polipropilénből vagy cellulóz alapú mélyszűrőkből készült felületi szűrők kapacitása 150-210 l/m², és akár háromszorosára is csökkentheti a betáplálás zavarosságát. A nyitott betápláló csatornás TFF készülék allantois folyadék derítésre is alkalmas, mivel a készülék alkalmasabb a tápcsatornán keresztüli minimális nyomásveszteségre, így csökkenti a csatorna elzáródását.
A másodlagos tisztázási lépés könnyen elvégezhető az NFF segítségével. A polipropilén, cellulóz és üvegszálas anyagok kombinációja általában jó hatásfokot mutat, és a másodlagos derítési lépés alternatívája a TFF és egy {{0}},65 μm-es vagy 0,45 μm-es mikroszűrő membrán eszköz használata, valamint az ozmotikus fluxus működtetése. ellenőrzés. Ebben a lépésben egy nyitott csatornás TFF eszköz használható hidrofil PVDF-fel vagy hidrofil PES membránnal.
Fontos megjegyezni, hogy a vírusrészecskék oldhatatlan törmelékanyaggal kapcsolódhatnak, ami jelentősen csökkentheti a vírustermelést a derítés során. Sóoldat használata csökkentheti ezt az összefüggést az influenzavírusok és a szilárd fragmentumok között, ami nagyjából kétszeresére növeli a termelést anélkül, hogy a vírusrészecskék integritását befolyásolná.
2.2.1.2 Az egymást követő emlős- és madársejtvonalakban termelődő vírusok
A közelmúltban egyes vírusvakcinák eltávolodtak a tojásalapú eljárásoktól a sejttenyészeten alapuló eljárások javára (különösen az influenza elleni vakcinák esetében). Ennek a váltásnak a fő oka az embrionális tojásokkal kapcsolatos vakcinagyártási problémák (azaz a tojásellátás hiánya, amely bármely baromfibetegség kitörése esetén) megelőzése. Ennek eredményeként jelenleg sokféle vakcinát és vírusvektort fejlesztenek emlősökből vagy madarakból származó folyamatos sejtvonalak, hagyományos sejtvonalak (például Vero, MDCK vagy HEK293 sejtvonalak) vagy szabadalmaztatott sejtvonalak felhasználásával.
Az expressziós rendszertől függően a vírus a sejten belül maradhat, sejtlízis lépést igényel, vagy a sejten kívül maradhat (lízis vagy bimbózás). A sejttenyészetből nyert szilárd terhelés és oldható tartalom sokkal tisztább, mint az allantois folyadékfázis. Ennek eredményeként az NFF technológia könnyebben megvalósítható, a kapacitás pedig lényegesen nagyobb. A szűrési kapacitás azonban nagymértékben függ a sejttenyésztési körülményektől, például a sejtsűrűségtől vagy a sejtek életképességétől a betakarításkor. Ezek a paraméterek befolyásolják a sejttörmelék és a makroaggregátumok mennyiségét, amelyek eltömíthetik a mélyszűrőket és membránokat, ami csökkenti a kapacitást.
Thomassen és munkatársai jó példával szolgálnak az NFF tisztázására. Az inaktivált poliovírus (IPV) gyártási folyamatában használják. Mikrohordozókon tenyésztett Vero sejteket használtunk a vírus proliferációjához {{0}},78 x 106 sejt/ml TOI sejtsűrűséggel. 75 μm-es rozsdamentes acél szitát használnak az előtisztításhoz, hogy eltávolítsák a mikrohordozókat a betakarításból. A kétrétegű osztályozást sűrűségű mélyszűrővel (0.{7}}.0 μm), majd sterilizált minőségű szűrővel tisztítják.
A kiválasztott méretezhető eldobható egységet sikeresen alkalmaztuk a Sabin IPV klinikai vizsgálati anyag elkészítéséhez 350 literes méretben. A vírus szerotípusától függően a vírus helyreállítási aránya 86 és 96 százalék között van.
2.2.1.3 A rovarsejtrendszerben termelődő bakulovírus/vírusszerű részecskék
A bakulovírus/rovarsejt-rendszerek nagyszabású vakcinagyártásban való megfontolása viszonylag új, de egyre nagyobb érdeklődést vált ki a vírusvektorok és VLP-k területén. Ennek a rendszernek a fő előnye, hogy rövid életű (nincs szükség sejtvonalak létrehozására) és biztonságos (nincs teljes vírus-DNS) termelés. Van néhány hátrány is, mint például a bakulovírus eltávolításának szükségessége és a termék stabilitása.
A Cervarix, a GlaxoSmithKline által előállított VLP vakcina humán papillomavírus fertőzés ellen, az első olyan humán vakcina, amelyet rovarsejtekben kereskedelmi forgalomban állítanak elő. Jelenleg számos, bakulovírussal fertőzött rovarsejtekben előállított VLP-n és rAAV-vektoron alapuló vakcina fejlesztése folyik. A Spodoptera frugiperda (Sf9 és Sf21) őszi seregféregből (Sf9 és Sf21) és a Trichoplusia ni káposztahajlárból (BTI-TN5B1-4 sejt) származó rovarsejtvonalakat használják a leggyakrabban, mivel képesek szuszpenzióban növekedni, ami leegyszerűsíti az upstream amplifikációját. folyamat. Miután az élő sejtek kívánt sűrűségére nőtt, ezeket a sejteket rekombináns bakulovírussal fertőzzük meg az exponenciális sejtnövekedési fázisban a fehérje expressziója érdekében. A bakulovírusok nagy genomja öt vagy több különböző fehérje expresszióját teszi lehetővé, ami megfelel a VLP és a vírusvektorok összetettségének.
Bernard et al. leírta a rovarsejt-tenyésztés downstream folyamatát. A folyamat nagyon változó, tükrözve az ezzel a technikával előállított fehérjék sokféleségét. A tisztítási szekvencia első lépését nagymértékben befolyásolja a bioreaktor térfogati jellemzői (azaz sejtsűrűség és életképesség), vagy a termék felszabadulás természete (a bimbózással vagy sejtlízissel kiválasztódik). A rovarsejtek bakulovírusfertőzése 3-5 napon belül sejtlízist okozhat. A sejtek pusztulása a proteolitikus aktivitás növekedéséhez és más környezeti tényezőkhöz vezethet, amelyek a rekombináns fehérjék lebomlásához vezethetnek.
Voltak kísérletek olyan bakulovírusok kifejlesztésére, amelyek gyengébb sejtlízist indító képességgel rendelkeznek. A bakulovírus a fertőzött rovarok kevesebb mint 10 százalékát lizálja.
A sejtlízist különböző módszerekkel lehet végrehajtani, például fagyasztással-olvasztással, detergensekkel, homogenizátorokkal vagy ultrahangos kezeléssel. A rovarsejteknek nincs sejtfaluk, ezért gyorsan feloldódnak. Bár az ultrahangos kezelést számos próbapadi eljárásban leírták, kísérleti vagy kereskedelmi méretekben ritkán használják. A legáltalánosabb módszer a sejtek elpusztítása homogenizálóval alacsony koncentrációjú detergens (0,1% Triton X-100 vagy NP-40) jelenlétében. A detergensek és a mikrofluidizálás vagy az ozmotikus hatású homogenizálás számos nagyüzemi gyártási folyamatban sikeresen alkalmazható. A rovarsejteket jellemzően lízispufferekben (50 mM TRIS pH7,7, 300 mM NaCl, 5% glicerin, 0,2 mM PMSF és proteáz inhibitorok) szuszpendálják, amely során a Triton-X100 0,1%-os végső koncentrációig adjuk hozzá, majd enyhe ultrahanggal vagy mikrofluidizálással. Az elegyet ezután centrifugáljuk az oldhatatlan részecskék eltávolítására.
Ebben a szakaszban a lizátum nagyon zavarosnak tűnhet, és nehéz szűrni 0,45 μm-es szűrővel. Néha akár 30%-os veszteség is megfigyelhető a pirolízis derítési lépése során. A hasítási szakaszban benzoenzimek hozzáadása segít a szűrési probléma megoldásában. A sejtek tisztítása foszfáttal pufferolt sóoldattal a betakarítás után, és gyors "fagyasztás-felengedés" magas sótartalmú (500 mM NaCl) oldatban, amely tartalmazza a krakkolási puffert, segít eltávolítani az aggregátumokat.
A rovarsejtek által termelt VLP-k és vírusvektorok tisztázása a sejtlízis után (kémiai vagy mechanikai kezeléssel) történik, amely során nem csak vírusrészecskék, hanem nagy mennyiségű sejtnukleinsav is szabadul fel. A rovarsejtek nagy sejtsűrűséggel képesek növekedni, 1-9.10 6 sejt/ml-től kezdve. Ezért a derítési lépésnek foglalkoznia kell a nagy sejtsűrűséggel, a magas nukleinsavtartalommal és lehetőség szerint a bakulovírus részecskék eltávolításával. A helyzet bonyolultabbá tétele érdekében a VLP-k vagy vírusvektorok és bakulovírusok hasonló méretűek lehetnek (a bakulovírusok szélesek 60-80 nanométer és hosszúak 300-400 nanométer). A nagy sejtsűrűség miatt évtizedek óta a centrifugálás volt a preferált módszer az elsődleges derítésre. A membráneljárások azonban nagyon vonzó alternatívának tűnnek, mivel a méretezhetőség könnyen meghatározható.
A mélyszűrőket hatékonyan alkalmazták a háromrétegű rotavírus-szerű részecskék lefelé irányuló folyamatában. Laboratóriumi szinten gyakran alkalmazzák a CsCl sűrűséggradiens ultracentrifugálási módszert ezen komplex részecskék tisztítására. A kutatók nemcsak a mélyszűrő derítési lépését értékelték, hanem a teljes downstream folyamatot is (Triton X-100 hasítás és mélyszűrés, majd ultraszűrés és részecskeméret-kizárás). Az eredmények azt mutatják, hogy a CsCl sűrűséggradiens hozama elérheti a 37%-ot.
Az ultracentrifugális módszer körülbelül 10%. Egy másik példaként 0,45 μm-es üreges szálakat és 500 kDa finom átmérőjű szálakat használtak a rovarsejtekben termelődő HIV-szerű részecskék visszanyerésére és koncentrálására. Ebben a vizsgálatban az üreges szálak nyíróerejét a sejt integritása alapján optimalizálták. Eredmények Az asztali cukor gradiens ultracentrifugálás helyett alacsony nyíróerejű eljárást hoztak létre.
Az eljárás tömeggyártásban is alkalmazható. A mélyszűrőket sikeresen alkalmazták rekombináns adeno-asszociált vírusok előállításában is. A sejtlízist kétdugattyús mechanikus sejtzavaró berendezéssel végeztük, majd nukleázos kezelést végeztünk. A derítési lépésben 1,2 μm-es üvegszálas mélyszűrőelemet, majd két réteg 0,8 μm hidrofil PES-t és 0,2 μm hidrofil PES-t használtunk. Az arányos méretű szűrőket a kisebbtől a 200 L-es méretű folyamattételekhez használják. A mélyszűrőket sikeresen alkalmazták, és a lapos filmekkel vagy 0,2 µm-es vagy 0,45 µm-es üreges szálakkal rendelkező TFF-besorolásokról is beszámoltak, hogy nagyon hatékonyak.
A portugáliai Oeiras Institute of Experimental Biology Tecnologica (IBET) tanulmánya az NFF-t használta a bakulovírusok által kifejezett hepatitis C VLP centrifugálás nélküli tisztázására. A névleges besorolású polipropilén szűrők (10, 5, 0,6 és 0,3 μm) szűrőket használnak a VLP betakarítás tisztázására. Ugyanazokat a szűrőket, 0,6 μm és 0,3 μm pórusbesorolású, használják a szűréshez a VLP begyűjtő központokban. Minden vizsgált szűrletet megvizsgáltak a HCV-VLP visszanyerési sebességére, és összehasonlították az ajánlott szűrési módszereket. Az eredményeket a 4. táblázat tartalmazza.
Az eredmények azt mutatták, hogy az 5 μm-0.3 μm-es szűrőnél volt a legmagasabb a termék visszanyerése (100%) a közvetlenül betakarított hepatitis C VLP takarmány esetében. A 0,6 μm-es polipropilén szűrőnél volt a legmagasabb termékvisszanyerés (82%) a központi betáplálásnál, és a gazdasejt DNS-tisztulása körülbelül 70%.
2.2.1.4 Bakteriális vagy élesztőrendszerekben termelődő vírusszerű részecskék
A bakteriális vagy élesztőrendszerben expresszált VLP-vakcinák tisztázási módszerének típusa a VLP extracelluláris mediátorokba való felszabadulásától függ. Ha a VLP-k nem szekretálhatók hatékonyan, sejtlízisre vagy más extrakciós lépésekre lehet szükség a tényleges derítési lépés előtt. Míg ez a fehérjetisztítási ipar aranystandardja, a centrifugálás (folyamatos vagy szakaszos) bakteriális vagy élesztő alapú rendszerekben kifejezve, újabban a membráneljárások nagyon vonzó alternatívává váltak a könnyű skálázhatóságuk és az egyszeri felhasználással való kompatibilitásuk miatt. kezelések.
Richter és Topell elmagyarázza a centrifugálás, a TFF vagy a kettő kombinációjának használatát a tisztított E. coliban termelt VLP-k elkészítésekor. Munkájuk során 0,45 m TFF membránokat használtak a homogenizált E. coli homogenizátumok hígításához és derítéséhez 5 fokos hőmérsékleten. Azt is megjegyzik, hogy a membrán alapú TFF alkalmas nagy viszkozitású betakarítások kezelésére, lehetőleg nyitott csatornás konfigurációjú TFF egységek használatával.
A centrifugális derítést a TFF alternatívájaként is értékelték. Ebben az esetben a kapott homogenizátumot nem hígítottuk, és 4 fokon centrifugáltuk 105 percig, 10000g. A lágy bevonat átvitele nélkül a felülúszót kiöntöttük a részecskékből, és 4 fokon 10 000 g-vel újra centrifugáltuk 60 percig. A felülúszót ezután eltávolítottuk a jelenlévő részecskékről, EB pufferrel (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10 % (v/v) Triton X-100) 1:2 arányban hígítottuk, és szűrtük. 0,22 m-es steril szűrőeszközön. További feldolgozás. A jelentések szerint ennek a VLP-vakcinának az E. coli-ban történő, 800 literes méretben történő előállításának nagyítási folyamatát a centrifugálás és a TFF kombinációja is tisztázta.
A HEV 239 rekombináns hepatitis E vakcinát Kínában engedélyezték 16 éves vagy annál idősebb felnőttek immunizálására. A vakcina antigének (VLP) E. coli-ban expresszálódnak, és az antigéntermelési folyamat felfutásáról kimutatták, hogy 50L-es léptékű. A terméket E. coli feltörésével extraháltuk, és a zárványtesteket 2% Triton X{5}} pufferrel végzett erős mosással választottuk el a sejtfragmensektől, majd 4 M karbamid-homogenizátorral oldottuk fel. A TFF tisztázza a Saccharomyces cerevisiae-ben (15 liter) termelt humán papillomavírus VLP-t. A nukleázzal kezelt sejtlizátumot keresztáramú mikroszűréssel tisztítottuk transzfiltrációs módban, 0,65 μm-es üreges rostszűrő használatával. Ugyanezt az eljárást alkalmazzák a vakcinagyártásban is. Bár csak néhány VLP-alapú vakcina jutott el kereskedelmi méretekhez, számos VLP-alapú vakcina fejlesztés alatt áll, amelyek többségét centrifugálással vagy membrántechnológiával tisztítják.
A tér befolyása által korlátozottan a tartalom második felét a következő fejezetben osztjuk meg. A következő cikkben megosztunk néhány esetet a vakcina tisztázásával és a releváns membránkomponensek használatával.
A lokalizációs kör első vállalataként a Guidling Technology elegendő releváns tapasztalatot halmozott fel a vakcinák tisztázása terén. A Guidling Technology egy fejlesztő és gyártó cég, amely a biogyógyszerészeti és sejttenyésztésre, a tisztításra és az elválasztásra összpontosít. A termékeket széles körben használják a biomedicinában, diagnosztikában, ipari folyadékszűrésben, kimutatásban, tisztázásban, tisztítási és koncentrálási folyamatban; A Guidling sikeresen fejlesztette ki az ultraszűrő centrifugacsövet, ultraszűrő/mikroszűrő membránkazettát, víruseltávolító szűrőt, tangenciális áramlású szűrőeszközt, mélymembránköteget stb., amelyek teljes mértékben megfelelnek a biofarmakon és a sejttenyésztés alkalmazási forgatókönyveinek.
Membránjainkat és membránszűrőinket széles körben használják az előszűrés, a mikroszűrés, az ultraszűrés és a nanoszűrés koncentrálására, extrakciójára és szétválasztására. Széles termékcsaládunk, a kis egyszer használatos laboratóriumi szűréstől a gyártási típusú szűrőrendszerekig, a sterilitásvizsgálatig, a fermentációig, a sejttenyésztésig és egyebekig kielégíti a tesztelés és a gyártás igényeit.