Irodalmi megosztás|Búcsúzni az összetett tisztításról? Egy új TFF + felületaktív módszer javítja a hatékonyságot és csökkenti az AAV vektor előállításának költségeit

A génterápia gyorsan fejlődik, mégis magas költségei továbbra is jelentős akadályt jelentenek, amely megakadályozza a szélesebb körű hozzáférést. Ennek a költségnek a legfontosabb mozgatórugói között szerepel az Adeno - kapcsolódó vírus (AAV) vektorok összetett termelési folyamata. A Biotechnológiában és a bio -hajtóművben közzétett tanulmány új tisztítási módszert dolgozott ki, amely ötvözi a tangenciális áramlás szűrést (TFF) a felületaktív anyagokkal, amely ígéri az AAV tisztítási folyamat egyszerűsítését és a költségek csökkentését. Merüljünk be ebbe a kutatásba, amelyet a Tokiói Egyetemen egy csapat vezet.

 

1. Kutatási háttér: Az AAV tisztítás kihívásai és jelenlegi állapota

Az AAV vektorok "csillag" beadási eszközökké váltak a génterápiában, magas biztonságuk, alacsony immunogenitásuk, mind a nem - elválasztó sejtek fertőzésének képessége és a hosszú- kifejezés génexpressziójának képessége miatt. Termelési folyamatuk azonban bonyolult, különösen a downstream tisztítási lépések, amelyek jellemzően a centrifugálás és a kromatográfia több fordulójával járnak. Ezek a módszerek - fogyasztó idő, szülés - intenzív, nehéz méretezhető és költséges.

Laboratóriumi skálán a tisztítás gyakran a cézium -klorid vagy a jodixanol sűrűséggradiens ultracentrifugálására támaszkodik, amely az ipari termelés méretét kihívást jelent. Az affinitáskromatográfiát egyre inkább használják, de az ahhoz szükséges alacsony pH -eluálási körülmények ronthatják a vírusfertőzőképességet. Ezért kritikus jelentőségű egy egyszerű, hatékony, szelíd és skálázható AAV tisztítási módszer kidolgozása.

A tangenciális áramlási szűrés (TFF) egy - alapú elválasztási technika, amelyet általában a - - pufferhez használnak. A hagyományos TFF -nek azonban korlátozott képessége van a szennyeződések, például a gazdasejtfehérjék (HCP) és a DNS eltávolítására az AAV tisztítás során, gyakran a fehérje aggregátumokat hagyva hátra.

 

2. Innovatív megközelítés: A TFF és a hatékony tisztítás felületaktív anyagokkal kombinálva

A tradicionális TFF korlátozásainak leküzdése érdekében a Rimi Miyaoka, a Yuji Tsuekawa és a Tokiói Egyetem kollégái okos stratégiát dolgoztak ki: felületaktív anyagok felhasználásával (500 kDa molekuláris molekuláris mérés), miközben megállítják a TFF ultrailtrációs membránját (500 kDa molekuláris mérés), lehetővé téve számukra, hogy áthaladjanak a TFF ultrasztrációs membránon (500 KDA molekuláris súlycsökkentés). méretben).

Három típusú felületaktív anyagot teszteltek:

• Non - ionos:Oktil -glükozid
• Anion:Nátrium -dezoxikolát
• Zwitterionic:Ropping

A tanulmány megállapította, hogy egy nem - ionos felületaktív anyag használata önmagában nem volt hatékony. Mind az anionos nátrium -dezoxikolát, mind a zwitterionic chaps szignifikánsan fokozta a maradék fehérjék eltávolítását, és különböző fehérjepopulációkat céloztak meg. Végül, ha a 0,5% -os nátrium -dezoxikoláttal 1% -os CHAP -kkal kombinálják, figyelemre méltó eredményeket eredményeztek, szinte teljesen kiküszöbölve a maradék gazdafehérjéket. Az SDS - oldalanalízis csak a három tiszta AAV kapszid fehérje sávot mutatta (VP1/VP2/VP3).

 

1. ábra. TFF tisztítási eljárás felületaktív anyagok nélkül;(A) SDS - oldal gél elektroforézis; b) Transmand elektronmikroszkópia (TEM)

 

1. ábra. TFF tisztítási eljárás felületaktív anyagokkal;(A) SDS - oldal gél elektroforézis; (b) Transmission elektronmikroszkópia (TEM)

 

3. Kutatási eredmények: Magas tisztaság, aktivitás és biztonság

1. Hatékony szennyeződés eltávolítása:Az új módszer a HCP -k 99,98% -os eltávolítását és a DNS 95% -os eltávolítását érte el, a tisztaság összehasonlítható az affinitáskromatográfiával vagy meghaladva.
2. Javított fertőzőképesség:Az in vitro kísérletek azt mutatták, hogy az e módszerrel tisztított AAV1 vektorok hatékonyabban fertőzték meg a HEK293 sejteket, mint az affinitási kromatográfia (24,9% vs. 20,8%) által tisztított, jelezve a vírus bioaktivitásának jobb megőrzését.
3. Jó in vivo biztonság:A tisztított AAV1 vektorok helyi injekcióját az egér vázizomba történő injektálása után két hét után nem figyelték meg szignifikáns gyulladást vagy szöveti károsodást, ami jó in vivo biztonságot mutatott.
4. Széles körű szerotípus alkalmazhatóság:A módszer sikeresen megtisztította a - több szerotípusot, beleértve az AAV1, AAV5, AAV8 és AAV9-FROM sejttenyésztő felülúszókat. Az AAV2 esetében azonban, amely elsősorban a nagy szennyeződéssel rendelkező sejtlizátumokban létezik, további optimalizálásra van szükség.

 

4. Összegzés és kilátások

Ez a tanulmány kifejlesztett egy egyszerű, gyors (1,5 óra), hatékony és skálázható új AAV tisztítási folyamatot. A nátrium -dezoxikolát és a chaps kombinálásával sikeresen foglalkozott a maradék fehérje aggregációjának a TFF tisztítása során.

A módszer előnyei a következők:

• A durva alacsony pH -körülmények elkerülése, a vírus aktivitásának jobb megőrzése
• A kromatográfiás lépések csökkentése, a munkafolyamat egyszerűsítése, valamint az idő és a költségek megtakarítása
• Könnyen skálázható, ipari nagy - méretaránytermeléshez alkalmas
• Új stratégia biztosítása más biomakromolekulák, például exoszómák, más vírusok és rekombináns antitestek tisztítására

A jelenlegi korlátozások magukban foglalják a szuboptimális vírus visszanyerését és az üres kapszidok elválasztásának képtelenségét a teljes vírusrészecskéktől, ami azt sugallja, hogy a legjobb felhasználása az első - lépés rögzítésként egy multi - lépés tisztítási munkafolyamatban lehet.

Összegezve, ez a kutatás vonzó új lehetőséget kínál a downstream AAV vektor előállításához, és jelentősen csökkentheti a génterápiás gyógyszerek költségeit, megkönnyítve szélesebb körű alkalmazást.