Tanulmány a rekombináns Escherichia coli nagy sűrűségű fermentációs lizátumának tisztázási folyamatáról
Az anyagfolyadék kromatográfiával való interferenciájának csökkentése és a célfehérje visszanyerésének javítása érdekében két rekombináns Escherichia coli törzs nagy sűrűségű fermentációs lizátumának derítési folyamatát tanulmányozták. A Streptococcus suis és a Haemophilus parasuis kulcsgénjeit kifejező BL21-HP1036 és BL21-palA törzseket választottuk ki. Tangenciális áramlási eljárást, nagy sebességű centrifugálási eljárást és membránkazettás derítési eljárást alkalmaztunk a fehérjehozam turbiditás és elektroforézis detektálással történő értékelésére.
Az eredmények azt mutatták, hogy a Streptococcus suis és Haemophilus parasuis kulcsgénjeit expresszáló BL21-HP1036, BL21-palA nagy sűrűségű fermentációs lizátumot membránkazettás szűréssel és centrifugálással tisztították, és a fehérjehozam 80% feletti volt. amelyek hatékonyan csökkenthetik a kromatográfiás interferenciát és javíthatják a visszanyerési sebességet.
Bevezetés
Jelenleg a Streptococcus suis (SS) és a Haemophilus parasuis (HPS) a leggyakoribb bakteriális betegségek kórokozói a sertéstelepeken, amelyek nagy veszteségeket okoznak a sertésiparnak. Az SS összesen 35 szerotípusra 1-34 és 1/2, a HPS pedig 1-15 szerotípusra osztható, és a kettő gyakran keveredik, főként sertések polyserositist, ízületi gyulladást, meningitist, endocarditist okozva. , bakteriális vérmérgezés és hörghurut.
A Streptococcus suis és a Haemophilus parasuis szerotípusainak nagy száma miatt gyenge a keresztvédelem a különböző szerotípusok között, és az antibiotikum-rezisztencia jelentősen megnő az antibiotikumokkal történő kezelés során, ami befolyásolja a terápiás hatást.
A vakcinák az SS és a HPS megelőzésének egyik hatékony eszközévé váltak. Léteznek inaktivált vakcinák, legyengített vakcinák, élő vakcinák, alegységvakcinák és génmanipulált vakcinák, de elsősorban inaktivált és attenuált vakcinák vannak forgalomban, ezek immunvédelme is jó, de a keresztvédelem nem szembetűnő. Az alegység vakcina a Streptococcus suis elleni új típusú vakcina, amely egy új típusú vakcina erős keresztvédelemmel és alacsony árral. A Streptococcus suis és Haemophilus parasuis alegység vakcináinak kutatása és fejlesztése tökéletes megoldást kínál a kínai sertésipart sújtó Streptococcus suis és Haemophilus parasuis megelőzési és védekezési problémáira.
A Streptococcus suis és a Haemophilus parasuis alegység vakcinákat nagy sűrűségű fermentációnak vetik alá rekombináns Escherichia coli által. A lizátum tisztázása nagy hatással van a célfehérjék hozamára, de kevés releváns jelentés áll rendelkezésre. Az erjesztési és tisztítási folyamat derítési lépésének megvalósítása fontos munka. Ebben a cikkben a rekombináns E. coli BL21-HP1036, BL21-palA nagy sűrűségű fermentáció a célja annak tanulmányozása, hogyan lehet hatékonyan csökkenteni a derítő oldat zavarosságát, javítani a fehérjehozamot, A Streptococcus suis alegység vakcina fermentációs folyamata az ipari aprítási és tisztázási technológia elérése érdekében, hogy elméleti alapot és technikai támogatást biztosítson.
1. Anyagok és módszerek
1.1 Anyagok
1.1.1 Törzsek
Streptococcus suis és Haemophilus parasuis BL21-HP1036, BL21-pa-lA törzsek
1.1.2 Fő közegek és reagensek
Élesztőkivonat és delfin; nátrium-klorid; Kanamycin, IPTG; Formaldehid ebből; SDS-PAGE gélkészlet.
1.1.3 Fő vizsgálati berendezés
Nagy sűrűségű fermentor; nagy sebességű centrifuga; Elektroforézis készülékek; Ultraibolya gél képalkotó rendszer; Ultrahangos zúzógép; Kisméretű nagy sebességű centrifuga; Ultraibolya spektrofotométer; Állandó hőmérsékletű rázóasztal; Affinitáskromatográfiás berendezés.
1.2 Módszerek
1.2.1. Nagy sűrűségű fermentációs kultúra
A minősített BL21-HP1036 és BL21-pa-lA rekombináns coliform törzseket 2%-os (V/V) szintetikus táptalajon oltottuk be, és 37 fokon tenyésztettük 35-40 órán át.
1.2.2 Rekombináns fehérje által indukált expresszió
Amikor a fermentációs oldat OD{{0}}±0,1, az indukció megkezdődött, az indukciós hőmérséklet 35°±0,5° volt, és a tenyésztést 10 óra indukció után befejeztük.
1.2.3 Nagynyomású homogén zúzás és centrifugálás
Az inaktivációs teszten átesett baktériumfolyadékot nagynyomású homogenizátorral zúztuk össze a sejtrepedéshez, 100-150 MPa nyomással. A zúzás után a zúzott folyadékot alacsony hőmérsékleten tartottuk.
A felülúszót nagy sebességű centrifugálással nyertük ki, centrifugális sebesség: 15000 ford./perc, hőmérséklet-szabályozás: 10-15 fok, injektálási sebesség: 0,5-1 l/perc, a felülúszót összegyűjtöttük, és a a felülúszót olyan tartályokkal töltöttük meg, amelyek eltávolították az endotoxint.
1.2.4 Mikroszűrő membránkazetta derítés
A membránt egy irányban 10L tisztított vízzel mostuk, majd érintőleges áramlású szűrést végeztünk. A centrifugálás után feltört baktériumszuszpenzióból 300 ml-t vettünk ki a csővezeték centrifugából, és 0,45 um-es mikroszűrő membránkazettával tisztítottuk. A zavarosságot rendre mintavétellel mértük, és összehasonlítottuk a centrifugálás utáni zavarosságot, a mikroszűrő membránkazettában lévő derített folyadék zavarosságát és a mikroszűrő membránkazettában lévő koncentrált folyadék zavarosságát. A minta fehérjetartalmát kromatográfiával és elektroforézissel határoztuk meg a fehérjehozam értékelésére.
2. lépés: Eredmények
2.1 A BL21-HP1036 és a BL21-palA fehérje tisztázó adatai és vizsgálati eredményei
ábrán látható eredmények. Az 1. ábra azt mutatja, hogy a BL21-HP1036 és BL21-palA rekombináns Escherichia coli zúzófolyadék zavarossága 4 500 NTU-ról és 4 000 NTU-ról 1970 NTU-ra, illetve 520 NTU-ra csökkent, cső centrifugálása után. A BL21-HP1036 és BL21-palA rekombináns Escherichia coli turbiditását 25 NTU-ra és 1,28 NTU-ra csökkentették mikroszűrő membránkazettás módszerrel. Látható, hogy a mikroszűrő membránkazettás tangenciális áramlási szűrés és az optimalizált nyitott áramlási csatorna alkalmazása jó hatással van az endotoxin, a kromatográfiás folyadék viszkozitásának és zavarosságának csökkentésére, mint a hagyományos centrifugás szűrés, és jelentősen csökkentheti a törött rekombináns E. coli heteroproteint és nukleinsav.
2.2 BL21-HP1036 és BL21-palA minták fehérje-visszanyerése
Az 1. táblázat azt mutatja, hogy rekombináns Escherichia coli BL21-HP1036 fehérje van mind a mikroszűréssel tisztított oldatban, mind a mikroszűrő membránnal borított koncentrált felülúszóban, valamint a teljes fehérjehozamot a fehérje mikroszűréssel tisztított oldatból és a koncentrált felülúszóból való kinyerése után. körülbelül 88,5%. A BL21-palA fehérje a mikrofiltrációs váladék derített oldatában és a koncentrált oldat felülúszójában is megtalálható volt mikroszűrő membránkazettával. A BL21-PALa fehérje összhozama 81,5% volt.
3. Következtetés
Ebben a cikkben a Streptococcus suis és a Haemophilus parasuis BL{{0}}HP1036 és BL21-palA kulcsgénjeit expresszáló törzsek nagy sűrűségű fermentáción mentek keresztül, és áthaladtak 0,45-ön. Az anyagfolyadék zavarossága szignifikánsan csökkentette az um mikroszűrő membránkazettás eljárás, ami azt jelzi, hogy a mikroszűrő membránkazettával végzett tangenciális áramlású szűrési technológia jobb volt, mint a nagy sebességű centrifugánál, és jelentősen csökkentheti a törött rekombináns Escherichia coli szennyezett fehérje és nukleinsav mennyiségét.
Miután összegyűjtöttük a tiszta folyadékot az egyetlen mikroszűrő membránkazettában, 62,9% volt, mivel a BL21-HP1036 célfehérjéjének 37,1%-a mikroszűrő koncentrátum volt, vagy a mikroszűrő membránkazettában volt, és egyéb veszteségek , kétlépéses módszert fogadtak el a tisztázás érdekében. Az első lépésben 0,45 um-es mikroszűrő membránkazettát használtunk a váladék tisztázására és összegyűjtésére; a második lépésben a csőcentrifugálás után visszamaradt koncentrált folyadékot összegyűjtöttük, majd a két lépésben tisztított folyadékot kromatográfiás mintaként egyesítettük. A BL21-palA fermentációs folyadék zavarossági értéke nem nőtt jelentősen, a fehérjehozam elérhette. több mint 85,5%, és a BL21-Pala fermentációs folyadék fehérjehozama kétlépéses kezelés után elérheti a 81,5%-ot.
Ami a mikroszűrő membránkazetta kiválasztását illeti, a Guidling Technology kiváló minőségű megoldásokat kínál. Mikroszűrő membránkazettás és ultraszűrő membránkazettás sorozat termékeink poliéter-szulfont használnak hordozóként, kifejezetten a biotechnológiához tervezve. Poliéter-szulfon membránunk előnyei a nagy áteresztőképesség, az alacsony fehérje adszorpció, a nagy mechanikai szilárdság, az ütésállóság és így tovább. Speciális membránbilincseket biztosítunk a bemeneti és kimeneti nyomás valós idejű mérésére, valamint az Ön igényeinek megfelelő műszaki látogatásokat biztosítunk speciális ultraszűrő/mikroszűrő rendszerének testreszabásához. Egy ilyen kis tangenciális áramlási rendszer használható kis, kísérleti és kisléptékű gyártáshoz, és teljesen lineáris erősítéssel is szolgálhat, hogy teljes mértékben megfeleljen az Ön vizsgálati és gyártási követelményeinek.
Guidlingről
A Guidling Technology egy nemzeti csúcstechnológiai vállalkozás, amely a biogyógyszerekre, a sejttenyésztésre, a biomedicina tisztítására és koncentrálására, a diagnózisra és az ipari folyadékokra összpontosít. Sikeresen fejlesztettünk centrifugális szűrőeszközöket, ultraszűrő és mikroszűrő kazettákat, vírusszűrőket, TFF rendszereket, mélységi szűrőket, üreges szálakat stb. Amelyek teljes mértékben megfelelnek a biogyógyszerek, a sejttenyésztés és így tovább. Membránjainkat és membránszűrőinket széles körben használják az előszűrés, a mikroszűrés, az ultraszűrés és a nanoszűrés koncentrálására, extrakciójára és szétválasztására. Számos termékcsaládunk, a kisméretű, egyszer használatos laboratóriumi szűréstől a gyártási szűrőrendszerekig, a sterilitásvizsgálaton, a fermentáción, a sejttenyésztésig és még sok másig megfelel a tesztelés és a gyártás igényeinek. A Guidling Technology alig várja, hogy együttműködjön Önnel!
