Útmutató a kiváló minőségű rekombináns fehérje tisztításhoz: Downstream folyamat optimalizálása és tangenciális áramlási szűrési alkalmazások

A rekombináns fehérjéket széles körben használják a biofarmakonokban, a vakcinák kialakulásában és az in vitro diagnosztikában . tisztítási minőségük közvetlenül befolyásolja a végtermék aktivitását, stabilitását és biztonságát . A downstream tisztítás a kritikus lépés a magas eljárást, a magas hozamú fehérjéket és a hatékonyságot, a hatékonyság és a hatékonyság, a hatékonyság, a magas hozamú fehérjék és egyre inkább létfontosságú eszközévé válik a fehérje tisztító munkafolyamatokban .

Ez a cikk szisztematikusan felvázolja a rekombináns fehérjék downstream tisztításának kulcsfontosságú lépéseit, különös tekintettel a TFF technológia alkalmazási stratégiáira . A kutatás és az ipari felhasználók segítése a tisztítási folyamatok optimalizálásában és a fehérjékminőség fokozásában .

 

I . alapvető lépések a rekombináns fehérjék downstream tisztításában

1. sejtek betakarítás és lízis

Centrifugálás/mélység szűrés: Eltávolítja a sejtek törmelékét és szennyeződéseit; alkalmas baktériumokhoz, élesztőhöz stb. ., expressziós rendszerek .

Sonikáció/nagynyomású homogenizáció: megszakítja a sejteket a célfehérjék felszabadításához; A feltételek optimalizálást igényelnek a fehérje denaturációjának megelőzése érdekében .

Enzimatikus lízis: e . g ., lysozim kezelése baktériumok; szelíd körülmények, de magasabb költségek .

2. Elsődleges tisztítás: a célfehérje rögzítése

Affinitáskromatográfia (E . G ., His-Tag, A/G protein): nagy specifitáskötés; nagy tisztaságot ér el egyetlen lépésben .

Ioncserélő kromatográfiát (IEX): elválasztja a fehérjéket a töltési különbségek alapján; alkalmas a korai és közepes szakasz tisztítására .

Hidrofób interakciós kromatográfia (HIC): a fehérje felületi hidrofób jellegének különbségeit használja; Hatékony bizonyos nehezen tisztítható fehérjékhez .

3. polírozás: A tisztaság fokozása

Méret-kizárási kromatográfia (SEC): eltávolítja az aggregátumokat és a kis molekulák szennyeződéseit; Korlátozott terhelési kapacitás .

Multimodális kromatográfia (e . g ., capto adagol): Több interakciós módot kombinál a magasabb felbontáshoz .

4. Koncentráció és puffercsere

Ultraszűrés centrifugális eszközök: alkalmas kisméretű mintákra; Hajlamos a fehérje veszteségre .

Tangenciális áramlás szűrés (TFF): hatékony, méretezhető, ideális ipari termeléshez (később részletezve) .

5. sterilizálás és tárolás

0 . 22 um szűrés: A sterilitást biztosítva a mikroorganizmusokat.

Stabilizátorok hozzáadása (E . G ., glicerin, BSA): megakadályozza a fehérje lebomlását .

 

II . A tangenciális áramlás szűrés (TFF) kulcsfontosságú alkalmazásai a downstream tisztításban

A tangenciális áramlás szűrés (TFF) csökkenti a membrán szennyezését a tangenciális áramláson keresztül, így alkalmassá teszi a koncentrálásra, a sótartozásra és a pufferre, hogy nagy-térfogatmintákat cseréljenek .. Jelentős előnyöket kínál a zsákutcák szűrése (E . g .}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}

 

1. A TFF technológia előnyei

✔ Magas visszanyerés: Minimalizálja a fehérje adszorpciós veszteségeit, különösen az értékes minták esetében .

✔ Lineáris méretezhetőség: A laboratóriumi skálán (10 ml) alkalmazható a termelési skálára (1000L+) .

✔ Folyamat rugalmassága: Egy rendszer képes koncentrációt, dialízist (puffercsere) és diafiltrációját elvégezni .

 

2. TFF kazetta/membránválasztási útmutató

Membránanyag	Jellemzők	Alkalmazási forgatókönyvek
Polyeterszulfon (PES)	Alacsony fehérjekötő, kémiailag stabil (pH -rezisztens), magas fluxus	Durva pufferfeltételek
Regenerált cellulóz (RC)	Alacsony fehérjekötő, magas fluxus, rutin fehérje	Rutin protein/antitest tisztítás

Molekulatömeg-küszöb (MWCO) Kiválasztási útmutatások:

A célfehérje molekulatömegének 1/3 - 1/5 (E . G ., használjon egy 10 kDa membránt egy 30 kDa -os fehérjére) .

Az aggregátumok eltávolításához válasszon egy kisebb pórusméretet (e . G ., használjon egy 50 kDa membránt egy 100 kDa fehérjéhez) .}

 

3. A kritikus TFF működési paraméterek optimalizálása

Transzmembrán nyomás (TMP): általában 3–15 psi; A túlzottan magas TMP elősegíti a . szennyeződést

Tangenciális áramlási sebesség: fenntartja a turbulenciát a koncentráció polarizációjának minimalizálása érdekében; Általában 4–8 l/perc · m² .

A hozamjavító technikák:

Használjon 2–5 puffermennyiséget a teljes csere során a . teljes csere során

Végezze el a hátsó öblítés végét a . maradék fehérje visszanyeréséhez

 

4. tipikus esettanulmány: monoklonális antitest (MAb) tisztítás

Tisztított sejttenyésztő folyadék → Affinitás kromatográfiája → alacsony ph vírusos inaktiváció → TFF koncentráció + puffercsere → polírozás (Sec/iex) → steril szűrés → steril szűrés

 

TFF szerep:

Gyorsan koncentrálja a híg fehérjét az A eluálási célkoncentrációra .

Csereli a puffert PBS -re vagy készítménypufferre (e . G ., hisztidin puffer) .

 

III . Általános problémák és megoldások

❌ 1. probléma: Alacsony fehérjetermelés

Lehetséges okok: membrán adszorpció; csapadék a túlkoncentráció miatt .

Megoldások: Váltás az alacsony kötő membránra; Adjunk hozzá felületaktív anyagot (e . g ., 0 . 01% Tween 20).

❌ 2. probléma: Gyors fluxus csökkenése

Lehetséges okok: Membrán szennyeződése vagy koncentráció polarizációja .

Megoldások: A tangenciális áramlási sebesség optimalizálása; Végezze el a rendszeres hátsó öblítés; Váltson egy nyitottabb membránszerkezetre (e . G ., 30 kDa 10 kDa helyett) .

❌ 3. probléma: Fehérje -aggregáció

Lehetséges okok: Túlzott nyíróerő; nem megfelelő puffer .

Megoldások: Csökkentse a szivattyú sebességét; Használjon szelídebb puffereket (e . g ., szacharózt vagy NaCl -t tartalmaz) .

 

IV . Összegzés

A kiváló minőségű rekombináns fehérjék beszerzése a downstream tisztítási folyamatok optimalizálására támaszkodik . Tangenciális áramlási szűrés (TFF) technológia, hatékonyságával és méretezhetőségével, a koncentráció és a puffercsere . című chromatográfiás és a chromatográfiás, és az integrációs chromatográfiai és és az integrációs chromatográfiás technikákkal, a puffercsere és a puffercsere, és az integrált cseréje révén, és az integrált, és integrálható kromatográfiás. továbbfejlesztett, kielégíti mind a kutatás, mind az ipari szintű termelés igényeit .